中心體蛋白N1p對乳腺癌細胞MCF-7轉(zhuǎn)移潛能影響的相關(guān)性研究.pdf

1、目的與背景:乳腺癌現(xiàn)已成為嚴重威脅全球女性生命健康的主要惡性腫瘤之一。其發(fā)病率呈現(xiàn)一個非常明顯的上升趨勢，年增長率2％至3％，近幾年在發(fā)展中國家更為明顯。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，2012年美國確診的乳腺癌新發(fā)病例226，870例，死于乳腺癌的患者39，510例。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。近幾年由于先進的診斷儀器和規(guī)范化系統(tǒng)治療的發(fā)展及普及，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早診率提高，患者的生存時間延長，死亡風險下降。因此，探討乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的危險因

2、素及干預(yù)措施是降低乳腺癌死亡率的重要措施之一。
　　中心體蛋白Nlp(ninein-like protein)是γ-微管蛋白復(fù)合物結(jié)合蛋白(GTBPs)的一員，是有絲分裂過程中必不可少的成分。Nlp的主要功能是促進微管成核，從而促進中心體成熟、紡錘體形成和染色體分離。幾乎所有的腫瘤和腫瘤來源細胞的中心體都在形態(tài)、構(gòu)成及功能上出現(xiàn)異常。中心體的異常改變會導致細胞周期的中斷，包括染色體不分離和多核表型，而這有可能會導致細胞轉(zhuǎn)化異常、腫

3、瘤形成和惡性程度的發(fā)展。幾乎所有的的腫瘤及腫瘤來源的細胞的中心體在形態(tài)及組成上存在異常擴增的現(xiàn)象，且有報道中心體異常存在于較低級別的腫瘤中，并且在侵襲性惡性腫瘤中逐漸增加。在晚期、復(fù)發(fā)的惡性腫瘤及具有侵襲能力的腫瘤細胞中，具有顯著的中心體異常改變。因此，中心體蛋白Nlp可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移侵襲的過程中起到重要作用。
　　本研究通過慢病毒基因轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)(Western blotting)、MTT法、克隆形

4、成及基因譜測序等細胞生物學技術(shù)，探討中心體蛋白Nlp對乳腺癌的生長增殖能力及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法:應(yīng)用PUBMED檢索NLP基因序列，NM_025176，采用人工構(gòu)建pEGFP-C1-NLP質(zhì)粒，同時以pEGFP-C1空載質(zhì)粒作為對照，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP-C1-NLP質(zhì)粒及pEGFP-C1空載質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到乳腺癌細胞系MCF-7中，分別構(gòu)建過度表達NLP的MCF7-GFP-NLP細胞及表達空載質(zhì)粒的MCF-7

5、-GFP細胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及Western blot法鑒定轉(zhuǎn)然后乳腺癌MCF-7細胞中Nlp的mRNA及蛋白水平的表達。應(yīng)用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞周期的變化。應(yīng)用MTT比色法、克隆形成實驗、Transwall侵襲小室的方法，比較MCF7-GFP-Nlp細胞與MCF7-GFP細胞系在增殖、侵襲轉(zhuǎn)移潛能的差異。并應(yīng)用Western blot法檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白CXCR4（細胞趨化因子受體4）在MCF7-GFP-NLP細胞及MCF-7

6、-GFP細胞中表達水平的改變狀況。對MCF7-GFP-Nlp細胞與MCF7-GFP細胞進行基因表達譜測序，篩選出差異基因。
　　結(jié)果:與MCF7-GFP細胞相比，MCF7-GFP-Nlp細胞的生長加快(P＜0.05)，MCF7-GFP-Nlp細胞與MCF7-GFP細胞克隆形成數(shù)目分別為:206±14.35，49±3.45，克隆形成率顯著上升(P＜0.05)。MCF7-GFP-Nlp細胞與MCF7-GFP細胞遷移至膜下的數(shù)目分別為:

7、878±18.22，398±8.02，與MCF7-GFP細胞相比，MCF7-GFP-Nlp細胞的遷移能力顯著增強(P＜0.05)。應(yīng)用Western blotting檢測結(jié)果顯示MCF7-GFP-Nlp細胞高表達CXCR4。差異基因表達譜測序結(jié)果，按照篩選標準共選擇出206個差異基因:與MCF7-GFP細胞相比，MCF7-GFP-Nlp細胞中上調(diào)基因46個，下調(diào)基因160個。
　　結(jié)論:細胞中Nlp高表達與乳腺癌細胞MCF-7細胞