LSD1對TGF-β1和Wnt通路以及EMT相關蛋白的調(diào)控作用研究.pdf

1、組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1（Histone lysine specific demethylase1，LSD1）是2004年由Shi Yang教授課題組首次發(fā)現(xiàn)并證實的在多種腫瘤細胞中高表達的一個賴氨酸特異性去甲基化酶。TGF-β1（transforming growth factor beta1，轉化生長因子β1）和Wnt信號通路都參與了不同的組織細胞或功能器官的正常生長發(fā)育過程以及癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。本文研究LSD1對經(jīng)典的TG

2、F-β1和Wnt信號通路以及對EMT（epithelial-mesenchymal transition，上皮細胞-間質(zhì)細胞轉換）過程的影響。
　　1) LSD1對TGF-β1表達的影響
　　課題組前期在探索侵襲和轉移機制研究過程中發(fā)現(xiàn)胃癌細胞 MGC-803中TGF-β1正向調(diào)控LSD1的表達，而在胃黏膜上皮細胞GES-1中，TGF-β1對LSD1表達的調(diào)控作用并不明顯。本課題將進一步探究LSD1對TGF-β1表達的影響，

3、以期了解LSD1和TGF-β1在胃癌細胞及正常胃細胞中調(diào)控機制的異同。首先利用脂質(zhì)體2000（Lipofectamine?2000，Lipo2000）和脂質(zhì)體3000（Lipofectamine?3000，Lipo3000）將構建好的LSD1過表達和干擾質(zhì)粒轉染細胞MGC-803和GES-1，然后用Elisa實驗技術檢測TGF-β1蛋白的表達：兩株細胞中，LSD1低表達后TGF-β1蛋白表達均下調(diào)，LSD1過表達后TGF-β1蛋白表達均

4、有所上調(diào)。同時進行 ChIP-qPCR（染色體免疫沉淀，chromatin immunoprecipitation assay，ChIP；實時熒光定量PCR，Real-time Quantitative PCR，qPCR）實驗檢測兩株細胞中 LSD1低表達后 LSD1和TGF-β1啟動子區(qū)之間的結合，結果發(fā)現(xiàn)TGF-β1啟動子區(qū)周圍的H3K4me2和H3K9me2水平都升高，后者更明顯。說明MGC-803中 LSD1與 TGF-β1之間

5、的相互作用屬于正相關調(diào)控，GES-1中二者作用與之不同。同時也證實了LSD1調(diào)控TGF-β1是與基因啟動子附近的甲基化水平高低相關的。
　　2) LSD1對Wnt通路相關抑制因子和關鍵蛋白的表達影響
　　前期文獻研究表明，結腸癌細胞中 LSD1可抑制 Wnt抑制劑 DKK1的轉錄，從而激活Wnt通路。胃癌細胞中LSD1對Wnt通路的調(diào)控機制尚不明確。本課題在細胞水平探討研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中LSD1對Wnt/β-cateni

6、n通路中相關蛋白的調(diào)控作用及其機制。在慢病毒載體建立的LSD1 knockdown（KD）細胞系中利用qPCR實驗檢測到 Wnt通路相關抑制因子 SFRP1，2，4，5（Secreted frizzled-related protein1，2，4，5）、DKK1（DickKDpf1）、WIF-1（Wnt inhibitory factor1），Wnt蛋白（Wnt3a）和蛋白β-catenin的mRNA表達有明顯變化。同時根據(jù)文獻查找LS

7、D1和Wnt通路相關抑制因子啟動子區(qū)之間的結合聯(lián)系，利用H3K4me2和H3K9me2抗體進行ChIP-qPCR實驗檢測LSD1低表達之后，發(fā)現(xiàn)Wnt通路相關抑制因子啟動子周圍的H3K4和H3K9甲基化水平有變化。結果說明了Wnt通路相關抑制因子的變化與其基因啟動子附近的甲基化水平高低有一定相關性，但是具體的作用機制尚未明確。
　　3) LSD1對Wnt蛋白和Wnt3a/β-catenin通路的作用
　　在慢病毒載體建立的L

8、SD1 KD細胞系 MGC-803和GES-1中，利用Western Blot，Elisa實驗檢測Wnt3a的表達發(fā)現(xiàn)LSD1低表達影響Wnt3a的分泌。分別加入PORCN（Porcupine）抑制劑Wnt-C59和Wnt3a/β-catenin通路抑制劑水飛薊賓作用48 h，Western Blot檢測相關蛋白的變化。MGC-803中Wnt-C59抑制LSD1低表達引起的Wnt3a分泌，Totalβ-catenin、p-β-caten

9、in和Total LRP6幾乎不變，加入水飛薊賓，Total LRP6和Totalβ-catenin減少明顯。GES-1中加入 Wnt-C59并未抑制 LSD1低表達引起的Wnt3a分泌，Totalβ-catenin和p-β-catenin不變，加入水飛薊賓，Total LRP6和Totalβ-catenin的變化與 MGC-803中不同。兩株細胞中檢測核內(nèi) p-β-catenin發(fā)現(xiàn)同一時間點LSD1低表達或加入水飛薊賓胞核中 p-β

10、-catenin的表達增加，不同時間點p-β-catenin先升高后降低。分析結果可知LSD1低表達影響Wnt3a分泌的同時抑制Wnt3a/β-catenin通路。
　　4) LSD1低表達對EMT標志蛋白的作用
　　課題組前期工作表明細胞MGC-803中LSD1促進EMT過程的發(fā)生，本課題注重探究LSD1低表達對EMT的影響，以及在細胞MGC-803和GES-1中的異同。在LSD1 KD細胞系MGC-803和GES-1中利

11、用Western Blot檢測EMT標志蛋白的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)在MGC-803中E-cadherin上調(diào)明顯，GES-1中EMT相關蛋白變化不大。說明MGC-803中LSD1對EMT進行正相關調(diào)控，GES-1中LSD1對EMT的調(diào)控并不明確。因此LSD1是否介導Wnt通路的EMT過程有待進一步研究。
　　生命現(xiàn)象的調(diào)控具有復雜性，本課題將抗腫瘤新型靶點LSD1與研究較為成熟的TGF-β1通路和Wnt通路聯(lián)系起來，進行相關蛋白的調(diào)