神經(jīng)元分化相關(guān)蛋白Dok5和MAP1B的功能研究.pdf

1、神經(jīng)分化是一種高度復(fù)雜的過(guò)程，包括了基因表達(dá)多層次、多步驟的調(diào)控。胚胎瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤都是胚胎發(fā)育期間形成的腫瘤，維甲酸可以誘導(dǎo)這兩種腫瘤細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，在研究神經(jīng)元分化機(jī)理時(shí)作為細(xì)胞模型得以廣泛應(yīng)用。 本文用維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y分化，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩查參與分化的蛋白。通過(guò)雙向蛋白電泳從中發(fā)現(xiàn)了73個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，誘導(dǎo)分化后表達(dá)降低的有51個(gè)蛋白，分化后表達(dá)增加的有22個(gè)蛋白。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電

2、離—飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，最終鑒定出40個(gè)差異表達(dá)的蛋白。對(duì)這些差異表達(dá)蛋白的分析結(jié)果表明，分化過(guò)程涉及能量代謝、膜運(yùn)輸、mRNA合成、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。分化后的細(xì)胞中受體酪氨酸激酶c-Ret表達(dá)量明顯增加。已有的研究表明Dok5可作為c-Ret的底物，促進(jìn)c-Ret介導(dǎo)的神經(jīng)突生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)室在Dok5的相關(guān)研究工作中也發(fā)現(xiàn)，用維甲酸誘導(dǎo)小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19向神經(jīng)元分化后Dok5表達(dá)量明顯增加。但Dok5如何介導(dǎo)神經(jīng)元分化目前還不清

3、楚。 Dok5是Dok家族成員之一，該家族成員的C-端被認(rèn)為是下游信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)，可作為活化的蛋白酪氨酸激酶誘導(dǎo)的信號(hào)復(fù)合物組裝的分子平臺(tái)。尋找其相互作用蛋白將對(duì)闡釋Dok5促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供有用信息。本文以Dok5的C-端為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫(kù)尋找其相互作用蛋白，共篩選到了132個(gè)陽(yáng)性克隆，代表27種蛋白，其中包括微管相關(guān)蛋白MAP1B的輕鏈LC1。MAP1B是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中最先表

4、達(dá)的微管相關(guān)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)行為在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。免疫共沉淀試驗(yàn)證明Dok5在體內(nèi)能與磷酸化的LC1相互作用。用免疫熒光對(duì)Dok5和LC1的細(xì)胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn)Dok5主要在質(zhì)膜上呈不連續(xù)分布，其與LC1在共定位于細(xì)胞的質(zhì)膜附近。MAP1B與Dok5的相互作用對(duì)闡釋Dok5在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能提供了新的線索。同時(shí)我們還初步嘗試了用串聯(lián)親和純化方法尋找與Dok5相互作用的蛋白復(fù)合體以獲得更多的功能信息，為全面闡