腫瘤相關(guān)抗原P1A的誘導(dǎo)表達(dá)及其增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷惡性腫瘤的研究.pdf

1、當(dāng)前，惡性腫瘤（包括惡性血液系統(tǒng)疾?。┑陌l(fā)生率和死亡率正處于不斷上升之中。盡管包括異基因干細(xì)胞移植等先進(jìn)的醫(yī)療技術(shù)和治療手段大大改善了惡性血液系統(tǒng)疾病患者的預(yù)后，但晚期和多次治療后復(fù)發(fā)的患者預(yù)后仍然很差。因此探索新的治療方法，已成為改善此類患者預(yù)后的迫切需要。
　　 惡性腫瘤的免疫治療早已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在過去的十年中，免疫治療在多種腫瘤治療中都獲得了令人注目的成就，這些治療手段包括細(xì)胞因子治療，局部免疫刺激，腫瘤疫苗和

2、異基因干細(xì)胞移植后的全身淋巴細(xì)胞輸注（DLI）等。然而，這些治療方法獲得部分成功的同時(shí)，卻未能使大多數(shù)腫瘤患者實(shí)現(xiàn)真正意義的治愈，甚至連腫瘤部分控制或縮小的目標(biāo)也未達(dá)到。其原因是腫瘤細(xì)胞的免疫逃避，或者是機(jī)體免疫細(xì)胞的無能。進(jìn)一步的研究表明，這種令人失望的現(xiàn)象是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞缺乏有效的免疫源性從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫細(xì)胞無法識別或抗原呈遞細(xì)胞無法有效地遞呈抗原。因此，如何增強(qiáng)腫瘤組織/細(xì)胞的抗原性，是腫瘤免疫研究領(lǐng)域一個殛待解決的首要問題。

3、r>　　 癌/睪丸抗原（Cancer/testis antigens CTAs）是一類在胚胎組織和滋養(yǎng)層細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)的抗原，并在大約40％的惡性腫瘤患者中存在，而在正常組織中幾乎沒有表達(dá)。表觀遺傳學(xué)研究表明，該類基因在腫瘤中的表達(dá)大多數(shù)情況下處于低水平或沉默狀態(tài)，其原因是其該類基因啟動子的異常甲基化造成的。由于睪丸等組織的免疫豁免特性和CTA抗原的分布特點(diǎn)，使得該類抗原成為近年來免疫治療的重要靶點(diǎn)之一。我們的前期研究表明，P1A是一種

4、重要鼠類CT抗原，在多種腫瘤細(xì)胞有異常分布。該基因的表達(dá)受甲基化調(diào)控，5-雜氮胞苷等藥物處理可恢復(fù)其表達(dá)。鑒于上述背景，我們從下述幾個方面進(jìn)行研究，旨在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫源性，并通過有效的抗原呈遞，進(jìn)而有效刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。
　　 一、用5-雜氮胞苷處理多種腫瘤細(xì)胞，并在5-雜氮胞苷處理前后對所處理腫瘤細(xì)胞進(jìn)行P1A的DNA和mRNA檢測，進(jìn)而闡明5-雜氮胞苷對腫瘤細(xì)胞P1A表達(dá)的影響，篩選受甲基化調(diào)控、便于體外、體

5、內(nèi)免疫研究的腫瘤細(xì)胞株（本研究中T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系EL-4符合上述條件）。
　　 二、對P1A的抗原表位（多肽片段）進(jìn)行人工合成，以此多肽片段刺激經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)成熟的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），而后以一定數(shù)量經(jīng)多肽刺激的DCs多次免疫BALB/c小鼠，使之產(chǎn)生針對P1A多肽的特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）。
　　 三、以免疫磁珠法分離小鼠脾臟內(nèi)的CTL，（CD90

6、+T細(xì)胞），以流式細(xì)胞儀檢測P1A特異性CTL對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效果；同時(shí)分離CD4+和CD8+，進(jìn)一步探討其各自在免疫殺傷中的作用。
　　 四、構(gòu)建荷瘤動物模型，在一定的時(shí)機(jī)經(jīng)尾靜脈給予荷瘤小鼠注射經(jīng)特異免疫刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒T細(xì)胞，并以生理鹽水、無關(guān)肽刺激的細(xì)胞毒T細(xì)胞為對照，觀察P1A特異性CTL對腫瘤組織生長的抑制作用。
　　 五、以CFSE為示蹤劑，進(jìn)一步檢測了特異性CTL在荷瘤小鼠體內(nèi)的歸巢運(yùn)動及分布，進(jìn)一步

7、探討克服免疫逃逸的有效方法。
　　 六、通過對不同方法處理的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行流式檢測，探討CTL殺傷腫瘤細(xì)胞機(jī)制。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-雜氮胞苷誘導(dǎo)癌/睪丸抗原P1A的表達(dá)存在明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。通過DC細(xì)胞的遞呈，有效地刺激小鼠產(chǎn)生P1A特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞，體外、體內(nèi)均證實(shí)其對P1A恢復(fù)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或組織均有殺傷作用；我們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞在特異性殺傷中起重要的作用，這種殺傷與癌/睪丸抗原的表達(dá)和識別密切相關(guān)。此