細胞毒抗腫瘤藥物的共同基因表達譜的研究.pdf

1、基因表達譜芯片技術是近年來發(fā)展起來的一項前沿生物技術，可以對成千上萬種基因的表達水平進行平行、快速、準確、高效的檢測?；蛐酒夹g對于藥物作用分子機制研究、藥物靶標的發(fā)現、多靶點高通量藥物篩選、藥物活性及毒性評價等領域具有無可比擬的優(yōu)勢。 細胞毒抗腫瘤藥物與不同的靶點結合后發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡的作用。雖然目前已有大量的文獻報道有關細胞增殖和凋亡的調控分子和反應通路，但是這些藥物作用靶點與細胞內其它的調

2、控分子或反應通路尚不完全清楚。由于不同的細胞毒抗腫瘤藥物所致的細胞表型變化相似，因此可以推測：不同的抗腫瘤藥物可能共享某些細胞內信號傳導通路，而這些細胞內傳導通路中的分子則可能與調控腫瘤細胞增殖和凋亡有關。因此，尋找新的細胞增殖和凋亡的調控分子和反應通路對于進一步了解藥物的作用機制和發(fā)現新的藥物靶點具有重要的意義。 本研究基于上述的設想，選擇了喜樹堿、紫杉醇、高三尖杉酯堿和放線菌素D作用于白血病HL-60細胞和肝癌QGY7703

3、細胞，利用基因芯片技術研究藥物反應的基因表達譜，并應用Genmapp分析軟件和Access軟件，對藥物反應基因進行聚類分析和藥物反應通路分析。并應用實時定量PCR對一些重要基因進行確證。結果如下： 1.為研究抗腫瘤藥物早期敏感反應基因表達譜，我們首先研究4個細胞毒抗腫瘤藥物對白血病HL-60和肝癌QGY7703細胞表型的影響。采用噻唑藍(MTT)法檢測紫杉醇、高三尖杉酯堿、喜樹堿、放線菌素D作用于HL-60細胞和QGY-7703

4、肝癌細胞24h的藥物半數抑制濃度(IC50)分別為0.025、320、79.85、2.67、μmol/mL和2.26、52.77、19.09、0.48、μmol/mL；實驗同時采用形態(tài)學觀察和流式細胞儀檢測細胞凋亡以及細胞周期，實驗表明，兩種腫瘤細胞與各藥物孵育1h，細胞形態(tài)未見變化，作用24h可見細胞破碎、數目減少；流式細胞儀檢測結果顯示，紫杉醇和高三尖杉酯堿作用24h可加速白血病細胞和肝癌細胞通過G1/S期，導致G2/M期阻和細胞凋

5、亡。 2.HL-60細胞和QGY-7703肝癌細胞分別用上述藥物的IC50處理1h后，實驗同時設加藥物溶劑的對照組。抽提細胞RNA，然后用熒光試劑制備cDNA探針，再與14400型基因表達譜芯片雜交，用ScanArray 3000掃描芯片和ImaGene 軟件分析熒光信號的強度和比值。選擇三次實驗雜交比值的平均值自然對數絕對值≥0.69作為判定基因表達差異標準，篩選出各藥物作用的早期反應基因。結果顯示，4個抗腫瘤藥物均誘發(fā)強烈的

6、細胞基因表達改變，其中紫杉醇和高三尖杉酯堿誘導HL-60和QGY7703細胞的反應基因最多。 3．應用Genmapp分析軟件對藥物反應基因進行聚類分析和藥物反應通路分析，發(fā)現4個抗腫瘤藥物可調控細胞內許多反應通路、功能基因或細胞組分。例如，紫杉醇可調控mRNA加工過程；高三尖杉酯堿可抑制蛋白酶體組分26S亞單位PSMC3、PSMD2和PSMD11表達；喜樹堿影響G蛋白信號通路中多條基因的表達；放線菌素D可調節(jié)絲裂素活化的蛋白激酶

7、(MAPK)通路、TNF-NFkB通路等，這些結果說明藥物起始靶點與許多已知的調控細胞增殖和凋亡的通路相連，而這些通路可以很好地解釋藥物的作用。此外，細胞毒抗腫瘤藥物還調節(jié)了一群組織特異的基因，如喜樹堿影響一些內臟器官、內分泌系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)的基因，放線菌素D也能調節(jié)一些正常胚胎干細胞基因表達，提示這些基因的改變可能與其毒性有關。 4．應用microsoft office Access軟件對藥物反應基因和藥物反應通路進行統(tǒng)計分

8、析，發(fā)現細胞毒抗腫瘤藥物之間在轉錄水平上可共享某些同向改變的基因或反應通路，其中2個藥物之間最多，共用反應基因和通路在3個藥物之間，甚至全部4個藥物都可見到，例如全部4個藥物在HL-60和QGY7703細胞中分別有17條乘140條共用反應基因以及7條和9條反應通路。在2個細胞系中，4個抗腫瘤藥物也有6條的共同反應基因，它們是GRN、MLL3、PSAP、ERP29、LRPAP1、ST3GAL4，也共享肌動蛋白—細胞骨架調節(jié)通路和粘著斑功能

9、調節(jié)通路。這些結果提示拓樸酶抑制、微管、核糖體和DNA模板干擾在轉錄水平上具有共同的下游作用，通過這些下游通路或分子可能最終導致相似的表型變化。 5．共用反應基因在功能上可分為：生長增殖相關基因、凋亡相關基因、糖代謝相關基因及其它功能基因4類，這些共用基因所編碼的蛋白生物功能多樣，分別參與了細胞周期調節(jié)，DNA、RNA和蛋白質合成，能量代謝，泛素(類泛素)蛋白酶體依賴的蛋白質降解，信號傳導通路、抗凋亡或促凋亡等重要的細胞生命活動

10、以及內質網以及線粒體等構成。 (1) 抗腫瘤藥物能顯著抑制細胞表達細胞周期相關基因，如蛋白磷酸酶2A、翻譯延長因子1、HnRNPB1等，這些基因參與了細胞有絲分裂、核酸合成、DNA復制和修復以及RNA加工和蛋白質合成：此外，還能抑制具有促增殖作用的腫瘤相關蛋白基因(如GRN、MLL3)的表達，表明抗腫瘤藥物可通過調節(jié)細胞增殖基因的表達，來抑制腫瘤細胞的生長甚至導致死亡； (2) 抗腫瘤藥物能誘導細胞表達促凋亡基因PMAI

11、P1以及抑制抗凋亡基因PSAP的表達，說明調節(jié)凋亡相關基因的表達也是抗腫瘤藥物誘導細胞凋亡的一個重要機制； (3) 抗腫瘤藥物能調節(jié)內質網以及線粒體構成誘導細胞凋亡，如ERP29是內質網腔膜蛋白，作為氧化還原酶和分子伴侶，參與蛋白質折疊和運輸。ARF5是囊泡轉運包被復合體形成所必需，參與了內質網和高爾基體間的蛋白轉運?？鼓[瘤藥物抑制兩者表達，可能阻斷蛋白在內質網與高爾基體的轉運，從而誘導內質網應激而使細胞凋亡。mitochond

12、rial ribosomal protein S18A 是線粒體核糖體組分，衰老細胞線粒體核糖體蛋白合成的準確性下降。isocitrate dehydrogenase 2參與三羧酸循環(huán)，SLC25A6 為ADP/ATP轉運子，因此，抑制參與能量代謝的基因表達可能會引起線粒體呼吸鏈功能缺陷或者ATP耗竭而導致細胞死亡。 (4)抗腫瘤藥物能抑制泛素(類泛素)蛋白體蛋白降解系統(tǒng)相關基因PSMC3、VCP 和SAE1表達。PSMC3是蛋

13、白酶體26S蛋白酶體19S調節(jié)亞基的核心組分，VCP/p97是一種AAA ATP酶，在輔助因子協助下，可使錯誤折疊的蛋白從內質網膜脫位進入胞漿，經泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。SAE1/SAE2是小泛素相關修飾劑(SUMO-1)活化酶，參與類泛素途徑調節(jié)，由于蛋白酶體參與細胞周期、增殖和凋亡調節(jié)，因此抑制泛素蛋白酶體途徑可能也是抗腫瘤藥物的一個重要機制。 (5) 抗腫瘤藥物能抑制唾液酸轉移酶4C和糖苷轉運子SLC35D1表達，而這二者均

14、在多種腫瘤中表達增加，參與腫瘤的轉移。因此，抑制蛋白糖基化可能與藥物的抗轉移作用有關。文獻檢索發(fā)現，有些共用基因已作為抗腫瘤藥物篩選靶點，例如，蛋白酶體抑制劑是一種新型的抗腫瘤藥物，已進入臨床實驗；基于蛋白磷酸酶PP2A分子模建，目前已設計了系列蛋白磷酸酶抑制劑，體內外結果顯示蛋白磷酸酶抑制劑具有廣譜的抗腫瘤效果。此外，唾液酸轉移酶抑制劑也能顯著抑制腫瘤生長和抗腫瘤轉移的作用。這些結果提示通過進一步的研究有望從這些共用反應基因中發(fā)現一些