含氮無(wú)鎳不銹鋼金屬支架材料對(duì)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況的影響.pdf

1、目的
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化常伴隨著患者的高血糖癥，患者血管內(nèi)血糖濃度較高。一般認(rèn)為，高血糖常抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。糖尿病與早期心血管疾病間的關(guān)系得到確認(rèn)，高血糖是內(nèi)皮功能障礙的主要原因。
　　目前臨床上廣泛應(yīng)用使用的316L不銹鋼支架材料含有鎳離子，鎳離子具有致敏、致癌和誘發(fā)血栓等毒副作用。其炎癥反應(yīng)刺激了支架周圍血管損傷部位細(xì)胞異常，研究認(rèn)為316L不銹鋼中的鎳離子釋放引起的接觸過(guò)敏加重了炎癥反應(yīng)，刺激支架周

2、圍新生組織的增生，增大了再狹窄的可能性。HNNF(Highnitrogennickelfree，HNNF)新型不銹鋼金屬是一種去除鎳元素添加氮元素的支架材料。
　　本論文通過(guò)結(jié)合高血糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同金屬支架材料上的增殖狀況，研究HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)活性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和基因表達(dá)等方面的影響，比較兩種不銹鋼金屬支架材料在支架再狹窄方面的優(yōu)劣，為新型支架材料的開發(fā)和改良提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方

3、法
　　1、高糖損傷模型的建立:
　　向含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中添加D-(+)-Glucose右旋葡萄糖配制5組梯度濃度的培養(yǎng)基。其葡萄糖含量終濃度分別為10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L，30mmol/L，為高糖組。普通RPMI-1640培養(yǎng)液為對(duì)照組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104/孔的細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，于37℃，5％CO2

4、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5和7天進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀與450nm波長(zhǎng)處測(cè)定沒孔的OD值。求出每組3個(gè)孔的平均OD值，然后計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率(relativegrowthrate，RGR)，RGR=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100％）。
　　2、觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況:
　　將體外培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，加入30mmol/L高糖培養(yǎng)液，將24孔

5、培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，待細(xì)胞細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層，取出長(zhǎng)有細(xì)胞的金屬片，用姬姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于金相顯微鏡下觀察HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。從形態(tài)上觀察高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不同金屬材料對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響
　　3、細(xì)胞生長(zhǎng)活性的測(cè)定:
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后

6、的1、3、5天取樣，通過(guò)CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值，求出每一組的平均OD值。計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增值率(relativegrowthrate，RGP)，對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
　　4、細(xì)胞周期分析:
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，

7、各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)22h，再更換為含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時(shí)間點(diǎn)分別取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　5、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組

8、均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不同不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響。
　　6、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于1.5mL離心管中，

9、做好標(biāo)記。按照TRIzol說(shuō)明書的要求提取RNA，測(cè)定各組RNA純度和濃度。按照Takara試劑盒說(shuō)明書的要求，反轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，并按照要求進(jìn)行Real-TimePCR的檢測(cè)。以基因GAPDH作為內(nèi)參，定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果
　　1、在不同糖濃度下對(duì)HUVEC細(xì)胞通過(guò)鏡下觀察、CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定、SOD測(cè)定和MDA測(cè)定，30mmol/

10、L濃度下是考察高糖環(huán)境下細(xì)胞增殖理想濃度。
　　2、通過(guò)鏡下觀察、CCK-8實(shí)驗(yàn)和對(duì)高糖環(huán)境下細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)，及流式細(xì)胞儀下細(xì)胞周期的檢測(cè)可以看出培養(yǎng)在0.62N不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)活性低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞(P＜0.05)，且均高HUVEC細(xì)胞在體外培養(yǎng)的正常水平。
　　3、通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)7天后細(xì)胞早期

11、凋亡和晚期凋亡比例高于0.62N不銹鋼金屬支架才上的HUVEC細(xì)胞。
　　4、通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的結(jié)果可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因caspase3、caspase8和FAS的基因表達(dá)水平高于0.62N組(P＜0.05)，而caspase9中的基因表達(dá)水平，0.62N組高于316L（P＜0.05）;自噬相關(guān)的基因ATG5、ATG7、ATG12中，316L組基因表達(dá)量高于0.62N組(P＜0

12、.05);細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclinE和cyclinA中，0.62N組基因表達(dá)量高于316L組。
　　結(jié)論
　　1、通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)活性、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡以及實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)0.62N不銹鋼金屬材料具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　2、與316L不銹鋼金屬支架材料相比，0.62N在成分上去除了鎳元素對(duì)細(xì)胞的潛在毒性作用，可能是其相較于316L不銹鋼金屬支架材料具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的