高糖對(duì)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、糖尿病是臨床常見的代謝性疾病，而血管病變則是其慢性并發(fā)癥的主要表現(xiàn)，為糖尿病患者預(yù)后和生活質(zhì)量的重要影響因素。多項(xiàng)研究表明，存在缺血性血管形成受損的糖尿病患者伴有視網(wǎng)膜的血管新生，即糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)。DR中的新生血管由于其功能不完善，從而引起玻璃體反復(fù)出血、纖維增生、視網(wǎng)膜脫離，最終發(fā)展為視力喪失。近年的研究發(fā)現(xiàn)，DR的新生血管與體內(nèi)的某種干細(xì)胞密切相關(guān).即內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells，

2、EPCs)，又稱為內(nèi)皮祖細(xì)胞，是近年發(fā)現(xiàn)的能自我更新、增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞的多能干細(xì)胞與血管新生關(guān)系密切。大量的證據(jù)表明EPCs在血管形成中起重要作用，尤其在缺血條件下，Grant等研究發(fā)現(xiàn)骨髓來源的EPCs在成人視網(wǎng)膜血管新生的模型中起重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明，NO也與糖尿病關(guān)系密切，糖尿病外周血中EPCs細(xì)胞數(shù)量減少可能與NO的減少有關(guān)，然而在DR中NO和EPCs與新生血管間的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察高濃度葡萄糖體外培養(yǎng)EPCs，旨在了

3、解高糖與EPC增殖的關(guān)系及NO在其中的作用機(jī)制。 我們從臍血成功分離出單核細(xì)胞，體外應(yīng)EPCs專用培養(yǎng)基EGM-2MV培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，免疫熒光染色鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志CD133、KDR、vWF的表達(dá)。體外培養(yǎng)的P2代細(xì)胞隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組：用EGM-2MV培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖組：葡萄糖終濃度為33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液；高糖+L-NAME組：含葡萄糖濃度33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液中加入

4、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase，eNOS)抑制劑L-NAME10μmol/L；甘露醇組(滲透壓對(duì)照組)：含甘露醇的終濃度為33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液。四組細(xì)胞各培養(yǎng)48小時(shí)，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，用CCK-8試劑分析細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，采用免疫熒光染色研究3-硝基酪氨酸(3-NT)蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)論：(1)通過密度梯度法可成功從人臍血分

5、離出血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。(2)高濃度葡萄糖培養(yǎng)EPCs可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，但卻不影響細(xì)胞分化。(3)高糖可使EPC表達(dá)3-NT蛋白增多，加入L-NAME后可明顯逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)細(xì)胞的增殖作用。由此可見，高糖對(duì)EPCs的作用機(jī)制可能是通過引起細(xì)胞釋放NO，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；高糖不影響EPCs分化，即不影響血管形成作用，而只是促進(jìn)了血管生成，從而生成糖尿病視網(wǎng)膜病變中的新生血管網(wǎng)。通過探究EPCs細(xì)胞增殖、分化的機(jī)制，研究血管發(fā)生和血管形成，可能為