吸入一氧化氮誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢防治支氣管肺發(fā)育不良的研究.pdf

1、前言：
　　支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是嚴(yán)重威脅小早產(chǎn)兒長期存活和生存質(zhì)量的一種慢性肺病。BPD發(fā)生的病理改變主要是肺泡簡化和肺血管異常。促進(jìn)受損肺血管的修復(fù)是BPD防治的新思路。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EpithelialProgenitor Cells，EPCs)是一類具有自我更新和高度增殖能力的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞。骨髓是多種干/祖細(xì)胞的重要儲(chǔ)存池。EPCs的歸巢(homing)是指在某

2、些生理或病理因素刺激下，骨髓內(nèi)EPCs動(dòng)員進(jìn)入血循環(huán)，動(dòng)員的骨髓EPCs或者移植的EPCs在歸巢因子的作用下歸巢至外周微血管系統(tǒng)，參與血管的生成和修復(fù)。研究顯示循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能障礙與BPD的發(fā)生有一定的相關(guān)性。EPCs用于修復(fù)缺血部位的血管的治療策略在臨床上已經(jīng)得到初步嘗試，主要集中于心血管領(lǐng)域。吸入一氧化氮(Nitric Oxide，NO)能降低小早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率，但是單一治療療效有限。動(dòng)物研究顯示，吸入NO能促進(jìn)骨髓EP

3、Cs動(dòng)員至肺，參與急性肺損傷的修復(fù)。以上研究啟發(fā)了我們這樣一個(gè)假設(shè)，吸入NO能否誘導(dǎo)移植EPCs歸巢至肺參與BPD血管損傷的修復(fù)。本研究圍繞這樣一個(gè)假設(shè)，第一部分開展eNOS/NO信號(hào)對(duì)EPCs歸巢功能的體外研究，第二部分建立大鼠BPD模型，研究外源性靜脈輸入EPCs同時(shí)吸入NO誘導(dǎo)移植EPCs歸巢能否達(dá)到防治BPD的協(xié)同作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。希望通過我們的研究能夠?yàn)閷砼R床移植EPCs同時(shí)吸入NO的協(xié)同治療BPD提供些許思路。

4、r>　　第一部分 eNOS/NO信號(hào)對(duì)EPCs歸巢生物學(xué)功能影響的體外研究
　　背景:EPCs是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞。EPCs具有趨向性，在血管損傷發(fā)生后，在細(xì)胞因子的作用下，EPCs能夠動(dòng)員并歸巢至血管損傷部分，參與損傷的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)。表達(dá)內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)是EPCs的一個(gè)重要特征。eNOS可以利用L-Arg、氧氣和輔因子產(chǎn)生NO。eNO

5、S/NO是骨髓EPCs動(dòng)員的重要信號(hào)。eNOS/NO信號(hào)在EPCs歸巢中的作用還不完全明了。Nω-硝-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethylester, L-NAME)是eNOS非特異性的抑制劑，可以競爭性抑制eNOS活性，減少NO生成。
　　目的:分離、純化、培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓來源的EPCs。觀察抑制eNOS活性對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓源性EPCs遷移、增殖、管腔形成等歸巢生物學(xué)活性的影響，并初步探討其作

6、用機(jī)制。
　　方法:分離大鼠股、脛骨骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)合纖連蛋白貼壁篩選法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)7-10天。熒光顯微鏡檢測培養(yǎng)所得細(xì)胞結(jié)合FITC-UEA-1和攝取Dil-ac-LDL的內(nèi)皮功能能力，采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測培養(yǎng)所得細(xì)胞CD34+比例。用L-NAME抑制培養(yǎng)所得細(xì)胞的eNOS活性后，采用細(xì)胞培養(yǎng)小室遷移系統(tǒng)、Matrigel體外管腔形成體系、增殖細(xì)胞的體外標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞學(xué)方法檢測培養(yǎng)所得細(xì)胞的遷移、血管樣結(jié)構(gòu)形成和增殖情

7、況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法和Western blot的方法檢測CXCR4、CXCR7、VEGFR2和eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平。采用硝酸還原酶法檢測細(xì)胞分泌NO的水平。
　　結(jié)果:分離所得細(xì)胞培養(yǎng)至第5天出現(xiàn)集落樣改變，培養(yǎng)7-10天出現(xiàn)典型的梭形、雙針樣改變，細(xì)胞融合度達(dá)到80％左右;FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL雙染細(xì)胞約85％左右;培養(yǎng)所得細(xì)胞CD34+細(xì)胞在68.2-72.4％之間。抑制eNOS活性

8、后，細(xì)胞遷移能力、增殖情況和管腔形成能力均顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)。抑制eNOS活性后， mRNA和蛋白水平上細(xì)胞表達(dá)CXCR4和eNOS均顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)，而CXCR7和VEGFR2的mRNA和蛋白表達(dá)受抑制不明顯。抑制eNOS活性后，細(xì)胞分泌NO的水平顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:成功分離和純化大鼠骨髓來源的EPCs。eNOS抑制劑L-NAME顯著降低骨髓來源EPCs表達(dá)eNOS，減少NO生成

9、。eNOS/NO對(duì)EPCs的遷移、增殖和體外管腔形成有調(diào)節(jié)作用，對(duì)EPCs歸巢分子CXCR4的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分吸入NO誘導(dǎo)EPCs歸巢防治新生大鼠BPD的研究
　　背景:BPD的發(fā)生是多因素的，其防治策略也包括多個(gè)方面，吸入NO和干細(xì)胞治療尚處于探索階段。吸入NO在臨床兒科主要用于新生兒低氧性呼吸衰竭和持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓，在BPD的防治療效中作用有限。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示移植EPCs至肺循環(huán)中，可以改善肺血管和肺泡

10、的發(fā)育。有研究顯示吸入NO能動(dòng)員早產(chǎn)豬骨髓EPCs、增加骨髓源性EPCs在肺內(nèi)定植、減輕肺血管損傷、促進(jìn)肺修復(fù)。急性肺損傷和BPD的發(fā)生在臨床上有一定的相關(guān)性和連續(xù)性，那么在BPD的防治策略上，能否將吸入NO和移植EPCs結(jié)合起來從而達(dá)到協(xié)同防治的目的。本部分通過動(dòng)物研究，探討吸入NO誘導(dǎo)移植EPCs歸巢至肺對(duì)BPD模型的防治作用，并探討其機(jī)制，為臨床治療BPD提供一些思路。
　　目的:建立新生大鼠的BPD模型。研究移植EPCs同

11、時(shí)吸入NO對(duì)BPD的防治作用，探討吸入NO誘導(dǎo)移植EPCs歸巢至肺的機(jī)制。
　　方法:將新生大鼠暴露于85％高氧中28天建立大鼠BPD模型。采用BrdU體外標(biāo)記培養(yǎng)的EPCs，通過大鼠尾靜脈注射至體循環(huán)的方法移植EPCs。實(shí)驗(yàn)分為6組，每組15只。空氣組（C組）:空氣中飼養(yǎng)28天。單純高氧組（O組）:85％高氧暴露28天。高氧+EPCs移植組（E組）:85％高氧暴露21天，第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個(gè)，繼續(xù)高氧暴露直

12、至28天。高氧+EPCs+L-NAME組（L組）:85％高氧暴露21天，第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個(gè)，同時(shí)腹腔注射L-NAME(20 mg/kg/天)，繼續(xù)高氧暴露直至28天。高氧+EPCs+吸入NO組（N組）:85％高氧暴露21天，第22天給予尾靜脈注射EPCs1×105個(gè)，同時(shí)吸入NO(5 ppm，連續(xù)7天)，繼續(xù)高氧暴露7天。高氧+EPCs+吸入NO+L-NAME組:85％高氧暴露21天，第22天給予尾靜脈注射EPC

13、s1×105個(gè)，吸入NO(5 ppm，連續(xù)7天)，同時(shí)給予腹腔注射L-NAME(20 mg/kg/天)，繼續(xù)高氧暴露直至28天。實(shí)驗(yàn)期間每日定時(shí)更換飼料、墊料、交換母鼠，觀察仔鼠生長情況和呼吸情況，對(duì)氧濃度、濕度和溫度監(jiān)測，實(shí)時(shí)監(jiān)測吸入NO濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測循環(huán)CD34+細(xì)胞水平;采用ELISA方法檢測血清VEGF的表達(dá)。自右心室沖洗肺循環(huán)后留取肺標(biāo)本。取右肺上葉和中葉組織液氮保存，采用實(shí)時(shí)熒光定量的

14、方法檢測VEGF、VEGFR2、eNOS和SDF-1 mRNA的表達(dá)。取右下葉液氮保存，采用Westernblot方法檢測VEGF、VEGFR2和eNOS的表達(dá)。。取右肺副葉液氮罐中保存，采用硝酸還原酶法檢測NO表達(dá)。左肺4％多聚甲醛固定，石蠟包埋后留做病理，HE染色分析肺的形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行輻射狀肺泡計(jì)數(shù);免疫酶組織化學(xué)方法檢測肺內(nèi)八因子的表達(dá);免疫酶組織化學(xué)方法和熒光免疫組織化學(xué)方法觀察移植EPCs在肺內(nèi)的定植情況。
　　結(jié)果

15、:根據(jù)研究目的，將結(jié)果分成以下五部分來介紹。
　　1、BPD模型的建立
　　新生鼠吸入85％氧氣2周后，毛發(fā)失去光澤，體重增加緩慢，脫氧后有明顯呼吸急促表現(xiàn)，重新給氧后，呼吸困難可緩解，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)高氧暴露組仔鼠體重顯著小于對(duì)照組。肺組織病理切片示:肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔直徑擴(kuò)大，肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔增厚。正常組小鼠肺組織病理切片示:肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整，肺泡大小均一，肺泡間隔較薄。
　　2、吸入NO同時(shí)移植EPCs對(duì)BP

16、D肺泡數(shù)目和肺血管的影響
　　肺組織病理顯示高氧干預(yù)各組肺泡腔直徑明顯擴(kuò)大，肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔增厚。輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(Radial alveolar count，RAC)顯示6組仔鼠RAC計(jì)數(shù)有顯著差異。兩兩比較顯示，空氣對(duì)照組RAC數(shù)目顯著高于其他各組;高氧+EPCs+吸入NO組RAC顯著高于其他高氧干預(yù)組。肺組織八因子免疫組化顯示C組、E組和N組的微血管密度分別高于O組、L組和S組。N組的微血管密度顯著高于其他各組。

17、　　3、吸入NO同時(shí)移植EPCs對(duì)循環(huán)CD34+細(xì)胞水平的影響
　　各組仔鼠外周血CD34+細(xì)胞水平有顯著差異。兩兩比較顯示，對(duì)照組CD34+細(xì)胞水平顯著高于O、E、L和S組;外源性輸入EPCs組（E組、N組）的CD34+細(xì)胞水平顯著高于高氧組和加用NO抑制劑組（L組和S組）;N組CD34+細(xì)胞水平顯著高于其他各組。給予EPCs同時(shí)加用eNOS抑制劑組CD34+細(xì)胞水平（L組）與單純高氧組無顯著差異，而在給予NO吸入后（S組）可顯

18、著提高CD34+細(xì)胞水平。
　　4、移植EPCs在肺內(nèi)的定植情況
　　移植EPCs能夠定植于肺組織中，N組EPCs肺內(nèi)定植高于其他各組，E組肺內(nèi)定植的EPC高于L組。
　　5、吸入NO同時(shí)移植EPCs對(duì)歸巢分子表達(dá)的影響(VEGF/VEGFR2、eNOS、SDF-1、NO)
　　(1)血清VEGF水平的變化
　　各組血清VEGF水平存在顯著差異。EPCs干預(yù)組（E組、L組、N組和S組）的血清VEGF水平顯著

19、高于非EPC干預(yù)組（C組和O組）。對(duì)照組血清VEGF水平較高氧干預(yù)組有增高趨勢。
　　(2) mRNA水平上VEGF/VEGFR2、eNOS、SDF-1的表達(dá)。
　　各組間VEGFmRNA的表達(dá)量有顯著差異。高氧干預(yù)各組（O組、E組、L組、N組和S組）的VEGFmRNA的表達(dá)量較空氣對(duì)照組顯著減少。E組VEGFmRNA水平顯著高于L組和S組;與N組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　各組間VEGFR2mRNA的表達(dá)量有顯著差異。

20、高氧干預(yù)各組（O組、E組、L組、N組和S組）的VEGFR2mRNA的表達(dá)量較空氣對(duì)照組顯著減少。O組、E組、L組、N組和S組的VEGFR2mRNA的表達(dá)量兩兩比較，無顯著差異。
　　各組間eNOSmRNA的表達(dá)量有顯著差異。C組eNOSmRNA顯著高于O組、L組和S組，而與E組和N組無顯著差異。N組eNOS表達(dá)顯著高于O組，有高于E組、L組和S組的趨勢。
　　各組間SDF-1mRNA的表達(dá)量無顯著差異。
　　(3)蛋白

21、水平上VEGF/VEGFR2和eNOS表達(dá)
　　各組間VEGF表達(dá)量有顯著差異。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，C組和N組VEGF蛋白表達(dá)顯著高于其他4組。C組和N組兩組比較無顯著差異。O組、E組、L組和S組VEGF表達(dá)無顯著差異。
　　各組間VEGFR2表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。
　　肺組織各組間eNOS表達(dá)量有顯著差異;EPCs干預(yù)各組（E組、L組、N組和S組）eNOS表達(dá)量顯著大于C組和O組;EPCs干預(yù)各組間兩兩比較，eNOS表