OA滑膜細(xì)胞中IL-18及PGE2含量測(cè)定及意義.pdf

1、研究背景：
　　 骨性關(guān)節(jié)炎(Ostearthritis OA)目前已成為全球最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病,有調(diào)查表明:我國(guó)60歲以上膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)49％,而且發(fā)病率有進(jìn)一步升高及年齡趨于年輕化的趨勢(shì)。OA嚴(yán)重影響老年患者的日常生活,并給國(guó)家和社會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)壓力,但OA的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。研究表明,多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,如骨形態(tài)蛋白(BMPs),轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGF),腫瘤壞死因子(TNF),白介素1(IL-1)等

2、都參與OA的致病過(guò)程,其發(fā)生機(jī)制主要是抗炎因子與促炎因子失衡導(dǎo)致的滑膜炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)軟骨破壞。形態(tài)學(xué)研究表明:OA病變主要是對(duì)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨造成破壞,而滑膜和軟骨的再生修復(fù)能力非常有限,一旦破壞幾乎不能逆轉(zhuǎn)。因此早期的干預(yù)避免OA的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。白細(xì)胞介素18(Interleukin-18,IL-18)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的致炎細(xì)胞因子,1995年由Okamura等從中毒性休克的小鼠肝臟克隆到了一種由應(yīng)激而誘生的蛋白,因該多肽能夠

3、誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ),還能增強(qiáng)脾T細(xì)胞增殖能力及脾NK細(xì)胞活性,與白細(xì)胞介素12(IL-12)的生物活性極相似,故最初被命名為IFN-γ誘生因子(IFN-γIGIF)。IL-18的主要生物學(xué)功能為介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng),且與一些自身免疫性疾病相關(guān)。研究表明,IL-18廣泛存在于關(guān)節(jié)炎患者的滑液、半月板和軟骨細(xì)胞中。Gracie報(bào)道在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑液和滑膜中測(cè)到的IL-18含量比OA中要高,而OA患者含量又比正常人

4、高。IL-18表達(dá)水平與OA活動(dòng)期關(guān)聯(lián)提示IL-18可能參與了OA的病因?qū)W環(huán)節(jié),特別是軟骨基質(zhì)的降解,軟骨細(xì)胞的凋亡和滑膜的炎性病變過(guò)程。PGE2是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種脂肪酸代謝產(chǎn)物,在OA的發(fā)病機(jī)制中PGE2起著重要的作用,它可以造成軟骨下骨的吸收,影響骨與軟骨合成代謝,阻止蛋白聚糖的生化合成,導(dǎo)致Ⅱ型膠原破壞,從而造成關(guān)節(jié)軟骨衰退。研究發(fā)現(xiàn):IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-r在關(guān)節(jié)液中能顯著刺激IL-6、IL-1α、NO、PGE2產(chǎn)生,抑

5、制蛋白聚糖產(chǎn)生,而使IL-8和IL-10下降,這表明IL-18在OA中最有可能是誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子。
　　 骨性關(guān)節(jié)炎的病因?qū)W主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是關(guān)節(jié)軟骨破壞導(dǎo)致軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性改變,二是滑膜炎癥反應(yīng)致使滑膜細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。有研究報(bào)道,OA中關(guān)節(jié)軟骨在致病因素作用下被破壞后,釋放碎片進(jìn)入滑液,刺激滑膜引起滑膜炎癥反應(yīng)?；ぱ揍尫叛仔越橘|(zhì),進(jìn)一步降解軟骨,周而復(fù)始造成惡性循環(huán),故滑膜炎的存在是OA軟骨損傷及OA

6、慢性持續(xù)化的重要因?yàn)?因此探討滑膜病變時(shí)滑膜細(xì)胞分泌的致炎細(xì)胞因子有何變化成為目前研究重點(diǎn)。為排除體內(nèi)病變時(shí)全身免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)可能對(duì)IL-18和PGE2分泌造成的影響,更直接的了解在OA病變中二者參與了滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程,本試驗(yàn)通過(guò)體外單獨(dú)培養(yǎng)正常滑膜細(xì)胞及OA患者滑膜細(xì)胞,運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞檢測(cè)法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,運(yùn)用ELISA和WESTERN檢測(cè)兩種滑膜細(xì)胞上清液中IL-18及PGE2表達(dá)水平的是否有差異,分析二者

7、表達(dá)量是否有相關(guān)性,明確二者是否參與了滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng),從分子水平上探討了IL-18和PGE2影響人OA發(fā)生的機(jī)制,為OA的臨床治療及后期研究提供理論依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1、觀察IL-18和PGE2兩種細(xì)胞因子在正常培養(yǎng)滑膜細(xì)胞及OA患者體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞中表達(dá)量的差異及二者表達(dá)的相關(guān)性,探討IL-18與PGE2在OA發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)性,探索IL-18與PGE2在OA致病過(guò)程中的作用,為進(jìn)一步研究IL-18與P

8、GE2在OA發(fā)病機(jī)制的分子通路提供線索。
　　 2、觀察體外細(xì)胞培養(yǎng)、傳代過(guò)程中滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,比較正?；ぜ?xì)胞和OA滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的差異。為日后進(jìn)一步研究IL-18和PGE2在OA及正常滑膜細(xì)胞中的表達(dá)選取合適的培養(yǎng)細(xì)胞,認(rèn)識(shí)滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的去分化現(xiàn)象。
　　 研究方法
　　 1、取材源自于正常關(guān)節(jié)滑膜組織和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織,體外培養(yǎng)兩種滑膜細(xì)胞,使用組織塊貼壁法分離接種,并原代培養(yǎng),倒置顯微鏡觀

9、察正常滑膜細(xì)胞與OA滑膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的差異,滑膜細(xì)胞傳代培養(yǎng),比較傳代滑膜細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)差異。使用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞檢測(cè)法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 2、運(yùn)用EIJISA和WESTERN檢測(cè)兩種滑膜細(xì)胞上清液中IL-18及PGE2表達(dá)水平的是否有差異,分析二者表達(dá)量是否有相關(guān)性,明確二者是否參與了滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng),從分子水平上探討OA發(fā)生的機(jī)制。
　　 3、統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0軟件,所測(cè)數(shù)據(jù)以(X)±S表示,

10、組間比較采用方差不齊的t檢驗(yàn),并對(duì)IL-18和PGE2之間行線性相關(guān)分析。P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、滑膜組織病理切片顯示:相比正?；そM織,OA滑膜組織出現(xiàn)明顯的血管增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn),符合組織慢性炎癥病變特征。OA滑膜細(xì)胞在原代培養(yǎng)的培養(yǎng)成活率比正?；ぜ?xì)胞低,并且所需貼壁及生長(zhǎng)時(shí)間比正?；ぜ?xì)胞長(zhǎng)?；ぜ?xì)胞原代多為長(zhǎng)梭形,有少量呈巨噬細(xì)胞樣；隨著傳代的進(jìn)行,細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上越來(lái)越類似成纖維細(xì)

11、胞,且傳3代后去分化現(xiàn)像越來(lái)越明顯。用抗Ⅰ型膠原抗體對(duì)第3代細(xì)胞行免疫組化鑒定可見(jiàn)細(xì)胞多呈陽(yáng)性細(xì)胞,胞質(zhì)濃染,呈黃褐色,但爬片細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)多不規(guī)則；采用FITC標(biāo)記的VCAM-1抗體進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定:在培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞中加入FITC標(biāo)記的VCAM-1抗體,有93.1％的細(xì)胞與VCAM-1抗體特異性結(jié)合并被熒光激發(fā),而對(duì)照組中(加入FITC進(jìn)行標(biāo)記,而沒(méi)有VCAM-1抗體)只有1.55％的細(xì)胞被熒光激發(fā),兩圖綜合證明我們培養(yǎng)的細(xì)胞至少

12、90.0％為滑膜細(xì)胞。在OA滑膜細(xì)胞中IL-18蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色深染,主要分布于胞漿內(nèi),部分細(xì)胞膜染色,也有少部分細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿與細(xì)胞膜同時(shí)著色,而在正常滑膜細(xì)胞中,胞漿輕度著色,大部分細(xì)胞不著色。
　　 2、原代培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞(正?；ぜ?xì)胞和OA滑膜細(xì)胞)上清液中,正常滑膜細(xì)胞IL-18表達(dá)水平比較低(17.735±1.467pg/ml,),PGE2(24.020±20.591pg/ml)表達(dá)也很低；OA滑膜細(xì)胞中IL-

13、18表達(dá)水平為(63.858±21.401pg/ml),高于正?；ぜ?xì)胞的表達(dá)水平(t=10.044,P<0.001)；PGE2(437.224±325.284pg/ml)表達(dá)也大大高于正?；ぜ?xì)胞的表達(dá)水平(t=5.926,P<0.001)。
　　 3、體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞上清中PGE2與IL-18濃度相互關(guān)聯(lián),線性相關(guān)分析表明,IL-18的表達(dá)與PGE2的表達(dá)存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.863,P<0.001)。
　　

14、結(jié)論
　　 1、原代培養(yǎng)OA滑膜細(xì)胞上清液中IL-18和PGE2兩種細(xì)胞因子的表達(dá)水平高于正?；ぜ?xì)胞上清液中的表達(dá)水平；這說(shuō)明IL-18和PGE2兩種炎性因子可能直接參與了OA的病因?qū)W環(huán)節(jié)。
　　 2、體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞上清液中IL-18和PGE2表達(dá)存在顯著正相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步說(shuō)明OA發(fā)生、發(fā)展過(guò)程這兩種細(xì)胞因子共同參與,相互作用。
　　 3、倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OA滑膜細(xì)胞從第三代呈現(xiàn)去分化趨勢(shì)形態(tài)學(xué)改變,提示基