應(yīng)力損傷和PGE2對(duì)共培養(yǎng)的PCL細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中LOX家族及MMP-1、2、3表達(dá)的影響.pdf

1、后交叉韌帶(Posterior cruciate ligament，PCL)在維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定中起重要作用，但嚴(yán)重的PCL損傷后卻難以完全恢復(fù)其原有的生物力學(xué)特征。PCL損傷過(guò)程中，機(jī)械應(yīng)力不僅導(dǎo)致PCL成纖維細(xì)胞及其鄰近的滑膜細(xì)胞出現(xiàn)損傷，還會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促使炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并作用于PCL成纖維細(xì)胞及滑膜細(xì)胞。細(xì)胞遷移是損傷組織修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但PCL損傷后產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)PCL成纖維細(xì)胞及滑膜細(xì)胞遷移的影響并不清

2、楚。據(jù)報(bào)道，機(jī)械應(yīng)力損傷和炎性細(xì)胞因子均能顯著刺激韌帶成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞表達(dá)和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)，并與韌帶損傷后的自我修復(fù)能力密切相關(guān)。另外，賴氨酰氧化酶家族(Lysyl oxidases，LOXs)通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的交聯(lián)也參與組織損傷后修復(fù)過(guò)程的調(diào)節(jié)。但是，PCL損傷后機(jī)械應(yīng)力的損傷刺激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子前列腺素E2(Prostaglandin E2)對(duì)P

3、CL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中LOXs及MMPs表達(dá)影響的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。并且，既往對(duì)PCL成纖維細(xì)胞的研究也較少考慮其與滑膜細(xì)胞間的相互作用對(duì)這兩種細(xì)胞的生物特性如細(xì)胞遷移、基因表達(dá)等的影響。
　　目的：
　　1、在PCL成纖維細(xì)胞或滑膜細(xì)胞單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的條件下，分別研究共培養(yǎng)環(huán)境和前列腺素E2對(duì)這兩種細(xì)胞遷移的影響；
　　2、在PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下，研究12％機(jī)械應(yīng)力損傷對(duì)這兩種細(xì)胞中LOX

4、s、MMP-1、2、3的表達(dá)和MMP-2活性的影響；
　　3、在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，研究PGE2對(duì)兩種細(xì)胞中LOXs、MMP-1、2、3的表達(dá)和MMP-2活性的影響。
　　通過(guò)對(duì)以上內(nèi)容的研究，從而探討嚴(yán)重的PCL損傷后自身難以滿意愈合可能的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，并用Transwell共培養(yǎng)此兩種細(xì)胞。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺素E2對(duì)單培養(yǎng)組

5、和共培養(yǎng)組24 h時(shí)PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞遷移的影響。將機(jī)械應(yīng)力損傷和PGE2對(duì)LOXs和MMP-1、2、3表達(dá)影響的研究分為兩部分。
　　第一部分主要研究不同處理因素對(duì)PCL成纖維細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)分為4組。
　　P①組：PCL成纖維細(xì)胞單培養(yǎng)組；
　　P②組：共培養(yǎng)組(PCL成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell下室)；
　　P③組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷組；
　　P④組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷+PGE2

6、組。
　　第二部分主要研究以上處理因素對(duì)滑膜細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)也分為4組。
　　S①組：滑膜細(xì)胞單培養(yǎng)組；
　　S②組：共培養(yǎng)組(滑膜細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell下室)；
　　S③組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷組；
　　S④組：共培養(yǎng)+12％應(yīng)力損傷+PGE2組。
　　處理后1、3、6和12 h提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR檢測(cè)LOXs和MMP-1、2、3的表達(dá)；處理后12、24、48和72 h提取細(xì)胞培

7、養(yǎng)液，明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2的活性。
　　結(jié)果：
　　1、與單培養(yǎng)的PCL成纖維細(xì)胞相比，共培養(yǎng)保持了更佳的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并使PCL成纖維細(xì)胞24 h時(shí)的遷移率增加至單培養(yǎng)的2.28倍；但PGE2分別使單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下PCL成纖維細(xì)胞24 h時(shí)的遷移率降低至相應(yīng)未處理對(duì)照組的72％和63％。
　　2、共培養(yǎng)也促進(jìn)了滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，使其24 h時(shí)的遷移率增加至單培養(yǎng)的1.48倍；但PGE2分別使單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下滑

8、膜細(xì)胞的遷移率降低至相應(yīng)對(duì)照組的86％和76％。
　　3、與單培養(yǎng)比較，共培養(yǎng)顯著增加了PCL成纖維細(xì)胞中LOXs的表達(dá)，分別使共培養(yǎng)12 h時(shí)LOX和LOXL1-4的表達(dá)增至單培養(yǎng)的1.24、1.25、1.48、1.66和1.17倍；但12％應(yīng)力損傷分別使共培養(yǎng)下PCL成纖維細(xì)胞中LOXs的表達(dá)降低至共培養(yǎng)未處理組的64.3％、41.6％、54％、44.6％和19.7％；在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進(jìn)一步使其表達(dá)

9、降低至29％、32％、28.4％、27.1％和12％。
　　4、共培養(yǎng)使滑膜細(xì)胞中LOXs的表達(dá)分別增加至單培養(yǎng)的1.41、1.5、1.66、1.38和1.37倍；但應(yīng)力損傷使LOXs的表達(dá)分別降至共培養(yǎng)未處理組的61％、54.5％、51.7％、60.4％和57.7％；在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進(jìn)一步使其表達(dá)降低至52.8％、51.5％、48％、50％和51％。
　　5、共培養(yǎng)12 h的PCL成纖維細(xì)胞中M

10、MP-1、2、3的表達(dá)分別較單培養(yǎng)組增高至1.35、1.73和1.45倍；共培養(yǎng)下，力學(xué)損傷分別使MMP-1、2、3的表達(dá)增高至共培養(yǎng)未處理組的4、1.67和3倍；PGE2在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步增高其表達(dá)至8.81、4.2和5.61倍。
　　6、共培養(yǎng)使滑膜細(xì)胞中MMP-1、2、3的表達(dá)也增高，分別達(dá)單培養(yǎng)對(duì)照組的1.78、1.55和1.31倍；應(yīng)力損傷使其表達(dá)分別增高至共培養(yǎng)組的1.88、1.17和2.93倍；前列腺素E2在共培養(yǎng)和應(yīng)

11、力損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增高其表達(dá)至2.75、2.01和3.23倍。
　　7、與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)使PCL成纖維細(xì)胞中72 h時(shí)MMP-2的活性增高至1.92倍；共培養(yǎng)下，應(yīng)力損傷也使其活性增高達(dá)共培養(yǎng)組的1.72倍；PGE2在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使其活性增高至共培養(yǎng)組的6.3倍。
　　8、與單培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)使滑膜細(xì)胞72 h時(shí)MMP-2的活性也增高達(dá)單培養(yǎng)組的1.78倍；共培養(yǎng)下，應(yīng)力損傷增高M(jìn)MP-2的活性至

12、共培養(yǎng)組的1.5倍；PGE2在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使其活性增高至共培養(yǎng)組的2.37倍。
　　結(jié)論：
　　1、共培養(yǎng)下的PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞之間存在著密切的交流，兩者相互作用，共同促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。
　　2、PGE2顯著抑制了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)下PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的遷移。
　　3、共培養(yǎng)使PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中LOXs的表達(dá)均增高，同時(shí)也增加了MMP-1、2、3的表達(dá)和MMP-2的活性

13、。
　　4、應(yīng)力損傷使共培養(yǎng)下PCL成纖維細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中LOXs的表達(dá)明顯降低，同時(shí)使MMP-1、2、3的表達(dá)及MMP-2的活性增高。
　　5、在共培養(yǎng)和應(yīng)力損傷共同作用的基礎(chǔ)上，PGE2進(jìn)一步降低兩種細(xì)胞中LOXs的表達(dá)；同時(shí)也進(jìn)一步增高M(jìn)MP-1、2、3的表達(dá)及MMP-2的活性。
　　6、應(yīng)力損傷和PGE2可能通過(guò)抑制細(xì)胞遷移、介導(dǎo)LOXs和MMPs表達(dá)或活性的異常從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解之間的平衡兩方面的作