苦參堿抗牛乳頭狀瘤病毒感染C127細(xì)胞研究.pdf

1、牛乳頭狀瘤病毒(Bovine Papillomavirus，BPV)是牛乳頭狀瘤病的病原體，BPV能夠引起牛的皮膚、黏膜上皮增生性病變，目前BPV已呈全球內(nèi)流行趨勢(shì)，帶給了養(yǎng)牛業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前防治牛乳頭狀瘤病的方法有外科手術(shù)治療法、中藥治療法及疫苗免疫法等。本研究利用BPV感染C127細(xì)胞，建立細(xì)胞感染模型，進(jìn)行牛乳頭狀瘤病防治藥物的體外篩選，為牛乳頭狀瘤病的臨床治療提供理論基礎(chǔ)及試驗(yàn)依據(jù)。
　　試驗(yàn)選取臨床典型的牛乳頭狀瘤

2、組織，對(duì)其進(jìn)行光鏡及電鏡觀察，通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)腫瘤組織中BPV，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序確定其基因型;BPV野毒株感染C127細(xì)胞，利用光鏡對(duì)比觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)病毒粒子分布;以利巴韋林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)苦參堿及氧化苦參堿對(duì)BPV直接滅活作用、抑制BPV在細(xì)胞內(nèi)增殖作用及預(yù)防BPV對(duì)細(xì)胞的感染作用，評(píng)價(jià)苦參堿及氧化苦參堿對(duì)BPV的作用效果;利用細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)藥物作用后，對(duì)染毒細(xì)胞的

3、凋亡影響，探索藥物作用機(jī)制。
　　結(jié)果表明:光鏡觀察可見(jiàn)腫瘤組織呈多個(gè)指狀突起，每個(gè)突起的中心為纖維組織和血管，突起外為多層鱗狀上皮細(xì)胞，異型性低，未見(jiàn)明顯角化，且無(wú)異常核分裂象。透射電鏡觀察可見(jiàn)腫瘤組織基底細(xì)胞、棘細(xì)胞及顆粒細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞形狀不規(guī)則、線粒體空泡狀等病理變化。間接ELISA法檢測(cè)腫瘤組織BPV呈陽(yáng)性反應(yīng);經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果與分離自中國(guó)的BPV-2病毒SW株(GenBank: KC256805.1)L1基因的相似

4、性高達(dá)99％。BPV野毒株感染C127細(xì)胞，細(xì)胞形狀變小、細(xì)長(zhǎng)、生長(zhǎng)密集、排列紊亂，PCR檢測(cè)在450bp左右出現(xiàn)特異條帶。細(xì)胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒粒子，并伴隨高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體變形等病理變化。通過(guò)藥物作用后染毒細(xì)胞CPE及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明具直接抗BPV作用的為:利巴韋林濃度為0.625μg/ml時(shí)抑制率最高，可達(dá)90％，苦參堿濃度為80μg/ml時(shí)抑制率最高，可達(dá)98％，與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01);

5、具預(yù)防BPV感染作用的為:苦參堿濃度為80μg/ml時(shí)抑制率最高，可達(dá)95％，與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01);具抑制BPV在細(xì)胞內(nèi)增殖作用的為:利巴韋林濃度為0.625μg/ml時(shí)抑制率最高，可達(dá)93％，苦參堿濃度為80μg/ml時(shí)抑制率最高，可達(dá)95％以上，與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01);而氧化苦參堿藥物最大無(wú)毒濃度的三種作用途徑對(duì)BPV的抑制率均低于30％，視為無(wú)效。BPV感染細(xì)胞24h時(shí)，已經(jīng)開(kāi)始抑制細(xì)胞凋亡，且細(xì)