微泡聯(lián)合診斷超聲波開放血腦屏障及促藥跨膜轉(zhuǎn)運的研究.pdf

1、背景與目的： Vykhodtseva首次發(fā)現(xiàn)超聲波能開放血腦屏障，開創(chuàng)了利用超聲技術穿顱骨治療的新領域，且對腦組織損傷甚微，擴大了無創(chuàng)性開放血腦屏障的研究前景。這一超聲技術不同于以往的超聲治療領域，而是利用具有診斷作用的超聲波頻率和強度在一定劑量的超聲造影劑作用下無創(chuàng)性開放輻照區(qū)的腦部血腦屏障，且這種作用為可逆性開放，達到了最低危險程度開放血腦屏障。故超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障成為近年國內(nèi)外研究的熱點。 血腦屏障本身的特

2、殊解剖學結構達到了對外來物質(zhì)通過的嚴格選擇性，從而維持了腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，確保腦的正常代謝和生理功能，對人體大腦起到了很好的保護作用。在腦部疾病的治療方面，BBB又被認為是阻止化療藥物進入腦組織進而影響療效的主要原因，導致抗癌等藥物無論是靜脈注射還是動脈灌注，都難以在腦組織達到有效濃度，不能充分發(fā)揮療效，如原發(fā)性腦瘤或繼發(fā)性腦瘤等疾病的治療，均需要藥物直接在腦部發(fā)揮作用。因此藥物在腦組織的療效不僅取決于病灶對藥物的敏感性，更主要的是取決于

3、血腦屏障對藥物的通透性，從有創(chuàng)性鞘內(nèi)或腦室穿刺直接給藥產(chǎn)生的技術操作要求較高且感染風險的限制性應用，到對藥物進行脂溶性化學修飾、改變分子量大小和電荷，設計出對BBB內(nèi)皮細胞的天然載體如葡萄糖、氨基酸、肽類載體，均是具有高度親和力的水溶性藥物，無創(chuàng)性促進藥物跨過BBB，使之在腦內(nèi)能達到有效的濃度，是神經(jīng)醫(yī)學發(fā)展的重點。而通過超聲波技術構建多功能的跨BBB藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)也逐步走向新的超聲治療研究領域。 超聲聯(lián)合微泡輻照腦組織，是基于靜

4、脈注射用于增強血管顯影的微泡造影劑后，以一定強度與頻率照射腦部，通過一系列示蹤手段與檢測方法證實血腦屏障開放，達到無創(chuàng)性可逆開放血腦屏障。 以上關于超聲聯(lián)合微氣泡開放BBB的確切機制尚不明確，還需進一步的深入研究論證，但可以肯定的是，其原理不同于高滲性溶液和其他有創(chuàng)性開放BBB的方法。本研究的目的是通過建立體外血腦屏障模型，探討超聲聯(lián)合微泡輻照作用下，血腦屏障通透性發(fā)生改變的機理與安全性，結合動物在體實驗研究，對比分析超聲聯(lián)合微

5、泡對BBB的影響，為將來的臨床治療提供試驗依據(jù)。 方法： 1.小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的分離與傳代培養(yǎng)：BALB/c小鼠腦組織塊經(jīng)0.1％胰酶消化后，篩網(wǎng)機械分離，最后不同密度Percoll液分層得到腦微血管內(nèi)皮細胞，在含有高濃度內(nèi)皮細胞生長添加劑的內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后傳代，得到穩(wěn)定的腦微血管內(nèi)皮細胞源；倒置顯微鏡常規(guī)觀察細胞形態(tài)及生長規(guī)律；BMVEC接種于涂有明膠的蓋玻片上，待生長呈單層后采用鏈霉親和素生物素過氧化

6、物酶復合物法檢測內(nèi)皮細胞特有VIII因子表達，鑒定分離培養(yǎng)的細胞是否為內(nèi)皮細胞；透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)部結構；四甲基偶氮唑比色實驗描繪細胞生長曲線。 2.將BMVEC培養(yǎng)在具在特殊質(zhì)材和孔徑的Transwell小室上建立BBB體外實驗模型；試漏實驗初步判斷BBB的形成；實時電阻測量BBB體外模型跨內(nèi)皮細胞電阻；體外BBB模型HRP實時通透性實驗；細胞內(nèi)部結構、表面形態(tài)與分布、緊密連接蛋白-1行透射電鏡、掃描電鏡、激光共聚焦顯微

7、鏡檢測。建立體外經(jīng)人顳骨標本血腦屏障細胞模型：顳骨片經(jīng)福爾馬林消毒后涂抹上耦合劑置于細胞小室上，模擬經(jīng)顱骨超聲聲窗條件，供體池注入微泡后進行超聲輻照。 3.超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障通透性的可逆性及安全性評價：應用水聽器對研究中所應用的超聲探頭進行聲學相關參數(shù)的測定，篩選出最佳超聲頻率與強度，為研究超聲引發(fā)相關生物學效應提供量化考查指標；探討跨內(nèi)皮細胞電阻實時測定與通透性發(fā)生改變的關系；實驗后細胞再培養(yǎng)3 d，觀察表面形態(tài)結構改變

8、以及電鏡觀察超微結構的變化，以考察微泡介導下超聲輻照對血腦屏障通透性影響的發(fā)生機制與安全性；免疫組化檢測緊密連接ZO-1蛋白表達是否與通透性相關；酶標儀檢測辣根過氧化物酶的通透量，描繪通透曲線，探討通透性增加的規(guī)律。 4.超聲聯(lián)合微泡提高BBB模型通透性的機理研究：根據(jù)分組在模型中加入自制的脂膜氟烷超聲造影劑，約2.0×107個左右微泡；采用經(jīng)顱超聲診斷儀輻照，時間10 min。分為4組，每組4個樣本：(1)對照組；(2)微泡組

9、；(3)超聲組；(4)超聲聯(lián)合微泡組。經(jīng)上述處理后，光鏡和電鏡觀察BBB細胞膜及超微結構改變，免疫組化檢測緊密連接ZO-1蛋白表達；在不同的時間點檢測TEER和HRP的通透性，探討可逆性開放BBB的機理。 5.微泡介導診斷超聲波輻照促順鉑跨血腦屏障轉(zhuǎn)運的實驗研究：根據(jù)是否加入微泡和超聲輻照，分為四組：(1)對照組；(2)超聲組；(3)微泡組；(4)超聲聯(lián)合微泡組。每組添加濃度為5ng/μl的生物素膠體金50μl和順鉑，順鉑達到9

10、μg/cm2，供池定容在460μl，分別于超聲輻照后再培養(yǎng)48h，并于再培養(yǎng)不同時間點從受池中取樣，待所有取樣結束后，采用高效液相色譜檢測順鉑的通透量；透射電鏡觀察細胞膜與細胞內(nèi)超微結構的變化以及膠體金的分布；實驗前后細胞小室行掃描電鏡能譜分析。 6.伊文思藍示蹤實驗：Sprague-Dawlty大鼠，固定麻醉消毒鋪巾，去除大鼠顱骨，加載經(jīng)處理后的人顳骨標本：將各組動物按分組給予相應處理30min后開胸，插管，灌注，直至從剪開的

11、右心房內(nèi)流出的液體變澄清，開顱取出腦組織，稱重，浸于含甲酰胺液體中，淬取，并用DU800紫外分光光度儀測定淬取液在EB溶液最大吸收峰處的光密度值得到EB的通透量。 7.超聲聯(lián)合微泡促順鉑跨血腦屏障轉(zhuǎn)運的體內(nèi)實驗研究：同EB檢測實驗過程與步驟處理后，解剖開顱，冰臺上取出腦組織，迅速在液氮中冷凍，稱重后加入提取液，在冰浴上研磨勻漿，離心20 min，取上清液行HPLC進樣分析。 8.硝酸鑭示蹤實驗：經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡引發(fā)血腦屏

12、障通透性改變的機理研究，配制硝酸鑭固定液與漂洗液；超聲輻照結束后，各實驗組大鼠在超聲波照射后不同時點麻醉、開胸、插管，硝酸鑭灌注固定液進行灌注，灌注后快速將動物以保鮮袋包好后4℃過夜，將過夜的動物取出，組織塊大小為1 mm3，隨之將組織塊進行相應處理包埋，半薄切片定位制成超薄切片，鈾染色，鉛染10s，透射電鏡觀察，拍照。通過體外血腦屏障模型的建議與研究，在體實驗結果進行對比分析，探討超聲聯(lián)合微泡對BBB的影響及促藥跨膜轉(zhuǎn)運作用。

13、 主要結果及結論： 1.成功建立體外血腦屏障模型：BMVEC培養(yǎng)至匯合后具有典型的“鋪路石”樣外觀；掃描電鏡顯示細胞形成致密單層，透射電鏡、ZO-1蛋白免疫組化證實細胞間形成光滑、連續(xù)、高密度的緊密連接；3H葡萄糖的通透率與實時電阻呈負相關，內(nèi)皮細胞電阻隨著通透性的增加而減低，建立的BBB體外模型在形態(tài)、電阻和對大分子物質(zhì)通透性方面具備了BBB的基本特性，掌握好電阻與通透性變化的動態(tài)規(guī)律，能夠為各類大分子物質(zhì)跨BBB能力的體外研

14、究機制提供參考價值。 2.光鏡和掃描電鏡顯示微泡介導下超聲波輻照，四組樣本細胞表面無明顯形態(tài)學改變和損傷，透射電鏡證實超聲聯(lián)合微泡組細胞間緊密連接向橋粒連接過渡，超聲組緊密連接減少，但沒有明顯細胞連接分離現(xiàn)象；ZO-1緊密連接蛋白免疫組化檢測于超聲聯(lián)合微泡組局部出現(xiàn)減弱甚至消失，超聲組無明顯改變；HRP通透率檢測顯示超聲聯(lián)合微泡組BBB通透率呈波浪形遞增與遞減，18h后完全恢復，超聲組BBB通透性增加，于30 min內(nèi)恢復，隨著

15、HRP通透量的減低，TEER逐漸恢復；電鏡、HRP通透率以及ZO-1蛋白表達在微泡組和對照組沒有明顯改變。表明：微泡聯(lián)合診斷超聲波介導下能通過短暫開放緊密連接，降低細胞間電阻，提高通透率，達到可逆性開放血腦屏障。 3.2MHz、0.6w/cm2、10 min的診斷超聲聯(lián)合微泡能夠促順鉑跨體外血腦屏障模型的轉(zhuǎn)運，透射電鏡觀察到內(nèi)皮細胞胞飲小體增多，細胞內(nèi)可見膠體金分布；單純超聲組細胞間隙可見少量膠體金分布，對照組和微泡組細胞內(nèi)外均

16、不能見到膠體金；掃描電鏡能譜分析，各組碳和鋅元素總量都沒有發(fā)生改變，但在超聲組和超聲聯(lián)合微泡組兩種元素的能譜分布發(fā)生轉(zhuǎn)變。經(jīng)HPLC檢測，順鉑通透量在超聲組與超聲聯(lián)合微泡組高于對照組與微泡組，組間比較有顯著差異。表明：微泡聯(lián)合診斷超聲波能通過短暫開放緊密連接，促進藥物順鉑跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運。 4.透射電鏡觀察在體硝酸鑭示蹤實驗標本：對照組及微泡組鑭顆粒僅位于血管腔中，均勻附著于毛細血管內(nèi)壁，血管外間隙無硝鑭顆粒沉積，緊密連接未見開

17、放，神經(jīng)纖維間亦未見有鑭劑沉積；超聲組在電鏡下可見除血管腔有鑭顆粒沉積外，毛細血管的內(nèi)皮下層、基底膜、神經(jīng)髓鞘間可見鑭顆粒沉積，神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜完整，胞質(zhì)分布均勻，細胞器正常；超聲聯(lián)合微泡組能見到血管緊密連接的開放，鑭劑沿著開放的緊密連接處連續(xù)滲出，但外滲的鑭劑并未在周圍出現(xiàn)明顯的聚集，而是沿整個血管斷面在血管外均勻分布，神經(jīng)細胞內(nèi)未見鑭顆粒沉積，神經(jīng)元胞核輕度均質(zhì)化，胞內(nèi)細胞器結構基本正常。 5.順鉑在體實驗檢測結果：超聲