TNF-α抗體對(duì)大鼠肝肺綜合征治療作用機(jī)制的研究.pdf

1、肝肺綜合征（Hepatopulmonary Syndrome，HPS）是一種與肝病有關(guān)的肺血管擴(kuò)張所致的以動(dòng)脈氧合下降為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。其病理基礎(chǔ)是肺血管擴(kuò)張。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但大多認(rèn)為是擴(kuò)血管因子一氧化氮（nitric oxide NO）產(chǎn)生過(guò)多造成的。
　　 NO是由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）以L一精氨酸為底物催化而成，NOS有三種異構(gòu)體形式，即神經(jīng)原型（nNOS）、內(nèi)皮型（e

2、NOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。其中eNOS和nNOS又合稱(chēng)為原生型（constitutiveNOS，cNOS），主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和血小板等，誘導(dǎo)合成正常生理需要量的NO。而iNOS主要存在于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)水平較低，經(jīng)細(xì)胞因子及內(nèi)毒素等誘導(dǎo)，iNOS表達(dá)增多。iNOS的作用時(shí)問(wèn)長(zhǎng)，可催化生成大量NO。iNOS的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，許多翻譯前及翻譯后因素參與其中，包括TNF-α在

3、內(nèi)的多種致炎因子和/或細(xì)胞因子，均可刺激iNOS的轉(zhuǎn)錄。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一種促炎性細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)、炎癥和對(duì)損傷反應(yīng)中起重要作用，主要影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒/細(xì)胞溶解、抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，還影響多種正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，并與其他細(xì)胞因子一起形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)。TNF-α主要是由單核-巨噬細(xì)胞分泌，其他類(lèi)型的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、平

4、滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力。
　　 肝肺綜合征在肝硬化患者中的發(fā)病率為10％-30％。目前，肝肺綜合征最有效的治療方法為肝移植，但由于肝源的有限性，使很多患者不能得到及時(shí)的治療。因此，肝肺綜合征藥物治療的研究尤為重要。有研究表明TNF-α抑制劑己酮可可堿在HPS大鼠模型中實(shí)驗(yàn)可以減少NO的形成量，因此受到啟發(fā)TNF-α單克隆抗體是否可以阻斷此信號(hào)傳導(dǎo)通路呢，而且目前TNF-α單克隆抗體已應(yīng)

5、用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心肌炎等炎癥性疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)采用TNF-α單克隆抗體對(duì)大鼠肝肺綜合征模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療，以便為HPS的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 目的：制作大鼠肝肺綜合征動(dòng)物模型，通過(guò)腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體，研究抑制TNF-α表達(dá)后NO、iNOS的表達(dá)的影響以及肺功能的變化。
　　 方法：采用膽總管結(jié)扎（common bile duct ligation，CBDL）大鼠肝肺綜合征模型，將60只

6、雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、模型組和干預(yù)組。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk、5wk麻醉動(dòng)物，干預(yù)組于結(jié)扎后第2周開(kāi)始腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體（0.1mg/kg/2d）于干預(yù)后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動(dòng)物，假手術(shù)組與5wk模型組動(dòng)物同批麻醉，留取肝組織、肺組織、血標(biāo)本。采用HE染色確定模型建立情況，Masson三色染色觀察肝硬化形成情況及干預(yù)組與模型組的對(duì)比；通

7、過(guò)檢測(cè)血?dú)夥治?、NO來(lái)了解肺功能的變化；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)iNOS在HPS形成過(guò)程不同時(shí)期及干預(yù)后不同時(shí)期肺組織中分布及含量的動(dòng)態(tài)變化；采用Western blot及RT-PCR方法分別檢測(cè)iNOS在HPS形成及干預(yù)過(guò)程中肺組織中mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、肝臟及肺臟病理改變
　　 CBDL組肝臟病理HE及Masson染色顯示肝臟小膽管廣泛增生，膽管擴(kuò)張，纖維組織增生，假小葉形成。干預(yù)組大

8、鼠肝臟HE染色顯示小葉結(jié)構(gòu)變化不明顯，小膽管仍有增生；Masson染色顯示門(mén)管區(qū)膠原纖維輕微增多，未見(jiàn)假小葉形成。假手術(shù)組HE染色肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊；Masson三色染色僅在門(mén)管區(qū)可見(jiàn)少量結(jié)締組織。
　　 CBDL組肺臟HE染色顯示大鼠肺臟肺泡隔增寬，肺間質(zhì)內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞。肺間質(zhì)毛細(xì)血管密度有所增加，提示肺間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血，部分區(qū)域的肺泡腔略變小。干預(yù)組肺臟毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張，肺泡間隔輕度增寬。假手術(shù)組肺

9、泡呈半球形的小囊，肺泡壁薄，相鄰肺泡之間可見(jiàn)由薄層結(jié)締組織構(gòu)成的肺泡隔，肺泡內(nèi)有連續(xù)的毛細(xì)血管和彌散存在的肺巨噬細(xì)胞。
　　 2、肝功能檢測(cè)：
　　 血漿ALT及TBIL在CBDL術(shù)后造模組1周明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。之后雖逐漸下降，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即較同周CBDL組明顯下降，P<0.05，有明顯差異。之后，呈下降趨勢(shì)，但仍明顯高于Sham組。

10、　　 3、血漿TNF-α檢測(cè)：
　　 CBDL術(shù)后1周血漿TNF-α水平即明顯升高，之后呈上升趨勢(shì)，3周時(shí)血漿TNF-α水平達(dá)高峰，4周時(shí)有所回落，5周又開(kāi)始回升，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即開(kāi)始明顯降低，之后繼續(xù)下降，至干預(yù)治療后4周仍高于同周Sham組。
　　 4、動(dòng)脈血?dú)夥治鰴z測(cè)：
　　 CBDL造模2周肺泡-動(dòng)脈氧分壓梯度差P（A-a）O2開(kāi)始出現(xiàn)增大，與Sham組比較P

11、<0.05，有明顯差異。之后呈上升趨勢(shì)。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后2周較CBDL術(shù)后同周組開(kāi)始下降，之后呈下降趨勢(shì)，至3周P（A-a）O2與同周CBDL組比較P<0.05，有明顯差異。但仍明顯高于Sham組。
　　 5、NO檢測(cè)結(jié)果：
　　 術(shù)后1周NO開(kāi)始上升，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。至3周末達(dá)到高峰后呈下降趨勢(shì)，但均明顯高于Sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周即開(kāi)始明顯降低，之后繼續(xù)下

12、降，至干預(yù)治療后3周仍高于Sham組，但無(wú)明顯差異。
　　 6、肺組織iNOS的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CBDL組iNOS蛋白陽(yáng)性表達(dá)較多，可見(jiàn)細(xì)胞胞漿呈棕褐色細(xì)顆粒，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多集中于吞噬細(xì)胞胞漿中；與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。TNF-α單克隆抗體干預(yù)后iNOS蛋白表達(dá)下降，表現(xiàn)為陽(yáng)性著色變少，但均明顯高于Sham組。
　　 Western blot分析iNOS蛋白表達(dá)，在130KD的

13、位置上出現(xiàn)雜交帶，從雜交信號(hào)強(qiáng)度可知，CBDL術(shù)后造模組1周肺組織iNOS蛋白表達(dá)即開(kāi)始明顯增加，與Sham組比較P<0.05，有明顯差異。至2周達(dá)高峰，之后又下降，并在一定范圍波動(dòng)。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周開(kāi)始明顯下降，與同周CBDL組比較，P<0.05，有顯著性差異；至干預(yù)后3周末與同周CBDL組有明顯差異，p<0.05；但與Sham組無(wú)明顯差異，p>0.05。
　　 RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)iNOS mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)

14、結(jié)果與上述兩種方法結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、進(jìn)一步證實(shí)了在肝肺綜合征的形成過(guò)程中，肝臟功能改變是肺功能變化的基礎(chǔ)。
　　 2、肝硬化動(dòng)物HPS的發(fā)生與TNF-α密切相關(guān)。
　　 3、iNOS源性NO是HPS形成機(jī)制中重要的因子。
　　 4、應(yīng)用TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療，可通過(guò)中和血漿TNF-α，部分降低血漿TNF-α水平、iNOS蛋白表達(dá)，NO生成減少，從而部分改善HPS的嚴(yán)重程度。