Akt家族在肝肺綜合征大鼠血清誘導PMVECs增殖中的表達研究-.pdf

1、背景與目的：
　　 肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎上出現(xiàn)肺內微血管異常擴張、氣體交換障礙、動脈血氧合作用異常而導致的一種綜合病征，在肝硬化患者中發(fā)病率可達15％，也是引起移植圍術期移植肝無功能及肺部感染的主要原因。盡管HPS的研究逐漸成為研究熱點，但其發(fā)生發(fā)展機制仍不明確，Sindhu等認為以肺內分流為主的血液分流是HPS的主要病因，其中肺內微血管擴張是肺內

2、功能性分流的形態(tài)學基礎。通過增強-對比超聲檢查、99m锝-多聚蛋白肺灌注顯像、肺血管造影等方法均可證實HPS患者肺內血管床在前毛細血管和毛細血管水平存在廣泛擴張，即發(fā)生顯著性的肺微血管擴張(Pulmonary vaso dilatation，PVD)。由于肺微血管主要構成細胞為肺微血管內皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)，因此顯著性肺微血管擴張(擴張直徑可達20-5

3、0μm)只能由PMVECs異常增殖完成。由此，目前絕大多數(shù)學者認為PMVECs異常增殖致使微血管擴張，擴張的微血管導致血紅蛋白氧合困難產生難治性低氧血癥和低氧肺血管重建(肺平滑肌細胞的異常增殖導致肺動脈壁增厚)而進一步加重低氧血癥，從而導致HPS的發(fā)生和進展。雖然HPS微血管擴張的機制尚不明確，但比較一致的意見認為：眾多的肝源性細胞因子通過血液循環(huán)作用于PMVECs后都促使其發(fā)生了增殖反應。由于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(serine

4、/threonine kinase，Akt)處于多條信號通路的重要交叉點，可調節(jié)細胞因子、生長因子等細胞生存信號，普遍存在于真核生物的調控網(wǎng)絡中，與多種增生增殖疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Akt相關通路后，對其他信號通路引發(fā)的細胞增殖現(xiàn)象有一定的抑制作用?；谝陨侠碛?，我們推測在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎上，血清中眾多的肝源性細胞因子作用于Akt家族，使PMVECs異常增殖，進而發(fā)生顯著性的肺微血管擴張，導致HPS的發(fā)生發(fā)展

5、，這正是本研究立題的目的所在。本研究采用建立HPS大鼠模型、培養(yǎng)PMVECs、MTT、3H-TdR摻入實驗、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chin Reaction，PCR)、蛋白印記(Western Blot)等技術和方法，通過HPS大鼠血清培養(yǎng)PMVECs，檢測PMVECs增殖情況、Akt家族(Akt1，Akt2，Akt3)的表達水平變化，探討HPS發(fā)生的原因和可能機制。
　　 方法：
　　 實驗分三部分：<

6、br>　　 1.建立HPS大鼠模型，提取血清
　　 采用的慢性膽管結扎法制備HPS大鼠模型，并鑒定。提取血清。
　　 2.PMVECs的培養(yǎng)以及增殖檢測
　　 取正常大鼠，原代培養(yǎng)、純化及鑒定PMVECs。PMVECs隨機分為2組：對照組(C組)和HPS干預組(HPS組)，孵育24、48和72 h(T1～3)，采用MTT法和3H-TdR摻入法檢測PMVECs增殖能力。
　　 3.Akt家族的mRNA以及

7、蛋白表達的檢測
　　 兩組PMVECs孵育24、48和72 h后采用RT-PCR法和Western blot法分別檢測Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA及其蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1.HPS大鼠血清對PMVECs增殖的影響
　　 與C組比較，HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs增殖能力增加，與T1時比較，T2，T3

8、時HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)。
　　 2.Akt家族的mRNA表達的檢測
　　 采用RT-PCR法檢測Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA，結果顯示：與C組比較，HPS組PMVECs Akt mRNA表達水平升高(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs Akt mRNA表達增強，與T1時

9、比較，T2，T3時HPS組PMVECsAkt mRNA表達水平升高(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs Akt mRNA表達增強(P<0.05)。
　　 3.Akt家族的蛋白表達的檢測
　　 采用RT-PCR法檢測Akt1蛋白、Akt2蛋白和Akt3蛋白，結果顯示：與C組比較，HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs Akt蛋白表達增強，

10、與T1時比較，T2，T3時HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.在HPS大鼠血清誘導下，PMVECs增殖能力增強，提示HPS大鼠血清可通過某種途徑導致HPS發(fā)生發(fā)展過程中PMVECs的增殖。
　　 2.隨著時間的延長，HPS大鼠血清誘導的PMVECs中Akt家族蛋白及其mRNA表達增強，表明