TNF-α、AR基因在多囊卵巢綜合征中的作用.pdf

1、背景：多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種以多囊卵巢，高雄激素血癥(HA)及持續(xù)性無排卵為主要特征的遺傳異質(zhì)性內(nèi)分泌代謝紊亂疾病。臨床上的家族聚集傾向提示遺傳因素在其病理生理中發(fā)揮了重要作用。
　　 國(guó)內(nèi)外對(duì)TNF-α基因-308G/A多態(tài)與PCOS的相關(guān)性進(jìn)行了研究，而其外顯子區(qū)域多態(tài)與PCOS相關(guān)研究未見報(bào)導(dǎo)。國(guó)內(nèi)外對(duì)雄激素受體基因多態(tài)與PCOS的相關(guān)性亦進(jìn)行了研究，主要集中在CAG重復(fù)多態(tài)，報(bào)導(dǎo)結(jié)果不一。最近的研究顯示AR基因

2、外顯子1中rs6152G/A多態(tài)與男性禿頂相關(guān)，男性禿頂是PCOS家族中男性的表型特征；rs6152G/A多態(tài)與PCOS相關(guān)研究未見報(bào)導(dǎo)。更近的研究揭示PCOS的患者存在外周血促炎因子如TNF-α水平的升高，提示PCOS中慢性炎癥作用，其機(jī)制尚未完全闡明。
　　 本文通過研究TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)-308G/A及外顯子1中rs3179060C/A及外顯子3中rs4645843C/T多態(tài)和AR基因外顯子1中rs6152G/A及CA

3、G重復(fù)多態(tài)與PCOS的相關(guān)性及其與高雄激素血癥之間的關(guān)系；TNF-α在多囊卵巢綜合征慢性炎癥中的作用，以期闡明PCOS的部分分子機(jī)制，為進(jìn)一步有針對(duì)性的臨床診斷及治療提供確鑿的理論依據(jù)，為PCOS的藥物治療開辟新的途徑。
　　 目的：探討腫瘤壞死因子α(TNF-α)基因啟動(dòng)子區(qū)域-308G/A，外顯1區(qū)rs3179060C/A及外顯3中rs4645843C/T三個(gè)多態(tài)與PCOS患者高雄激素血癥形成的關(guān)系。
　　 方法：選

4、自2006年6月至2008年2月在中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院就診的漢族PCOS患者130例。診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2003年鹿特丹歐洲生殖年會(huì)(ASRM/ESHRE)修訂的標(biāo)準(zhǔn)，即：1、月經(jīng)紊亂導(dǎo)致的排卵稀發(fā)或無排卵；2、臨床或生化的雄激素過多癥；3、超聲觀察到多囊卵巢。且排除其他疾病，如先天性腎上腺增生，分泌雄激素的腫瘤、柯興氏綜合征、甲狀腺功能不全，高泌乳素血癥,遲發(fā)的21羥化酶缺陷等，符合上述3項(xiàng)中的2項(xiàng)者即可確診為PCOS。本實(shí)驗(yàn)入選研究

5、對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)為B超顯示單側(cè)或雙側(cè)卵巢內(nèi)基礎(chǔ)卵泡>12個(gè)與血清睪酮增高或者B超顯示單側(cè)或雙側(cè)卵巢內(nèi)基礎(chǔ)卵泡>12個(gè)與月經(jīng)稀發(fā)(周期>37天)，同時(shí)排除其他內(nèi)分泌紊亂所造成的高雄激素血癥。選擇同期在本院生殖中心因輸卵管阻塞或男方因素行體外受精.胚胎移植(IVF-ET)的患者175例作為對(duì)照組，月經(jīng)周期正常，無內(nèi)分泌紊亂，無高血壓、心血管疾病、糖尿病家族史。于月經(jīng)周期2-4天或閉經(jīng)患者任何時(shí)期抽取肘靜脈血3ml，取300ul全血，用構(gòu)椽酸鈉(A

6、CD)抗凝，采用全血DNA分離試劑盒，提取基因組DNA。剩余全血分離血清待測(cè)激素水平。
　　 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(PCR-RFLP)分析TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)-308G/A多態(tài)；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-高保真酶介導(dǎo)的SNP敏感分子開關(guān)技術(shù)(PCR-On/off Switch)檢測(cè)TNF-α基因rs4645843C/T及rs3179060C/A多態(tài)，比較各多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率及各等位基因頻率分布，分析各多態(tài)與PCO

7、S高雄激素血癥之間的關(guān)系，
　　 結(jié)果：
　　 1.TNF-α基因因啟動(dòng)子-308G/A多態(tài)GG,GA，AA三種基因型頻率在對(duì)照組和PCOS組中分別為83.4％，15.4％，1.2％和90.8％，8.4％，0.8％；G, A基因頻率分別為91.1％，8.9％和95.0％，5.0％。在兩組中基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.196，0.069)。
　　 2.TNF—a基因rs3179060C/A多態(tài)C

8、C，CA，AA三種基因型頻率在PCOS及對(duì)照組分別為58.4％，23.1％，18.5％和72.O％，17.7％，10.3％；C，A兩種等位基因頻率分別為70.0％，30.O％和80.9％，19.1％?；蛐皖l率和等位基因頻率在兩組中分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(P=0.035，0.002)。
　　 3.TNF-a基因rs4645843C/T多態(tài)CC，CT,TT三種基因型頻率在PCOS組和對(duì)照組分別為34.6％，58.5％，6.9％和

9、43.4％，53.7％，2.9％；C，T兩種等位基因頻率分別為63.8％，36.2％和70.3％，29.7％。三種基因型和兩種等位基因頻率分布在兩組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.108，0.093)。
　　 4.TNF-a基因-308G/A,rs3179060C/A和rs4645843C/T三個(gè)多態(tài)各等位基因與PCOS高雄激素血癥無明顯相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.中國(guó)漢族人群TNF-a基因rs3179060C

10、/A多態(tài)與PCOS存在一定的相關(guān)性，但與高雄激素血癥之間無明顯相關(guān)，rs3179060C/A多態(tài)可能在PCOS的發(fā)病中發(fā)揮了一定的作用，對(duì)高雄激素血癥影響不明顯。
　　 2.中國(guó)漢族人群-308G/A多態(tài)，rs4645843C/T多態(tài)與PCOS及高雄激素血癥均無明顯相關(guān)，可能不是PCOS的主要致病因素。
　　 目的：探討雄激素受體基因外顯子1(CAG)n重復(fù)序列構(gòu)成的VNTR多態(tài)和rs6152G/A多態(tài)與中國(guó)漢族多囊卵巢

11、綜合征(PCOS)患者高雄激素血癥形成的關(guān)系。
　　 方法：
　　 研究對(duì)象PCOS選自2006年6月至2008年10月在中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院生殖中心就診的漢族PCOS患者224例，診斷標(biāo)準(zhǔn)同第一部分：選擇同期在本院生殖中心因輸卵管阻塞或男方因素行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的患者223例作為對(duì)照組，月經(jīng)周期正常，無內(nèi)分泌紊亂，無高血壓、心血管疾病、糖尿病家族史。
　　 應(yīng)用測(cè)序技術(shù)檢測(cè)224名PCO

12、S患者及223名對(duì)照婦女AR基因CAG微衛(wèi)星多態(tài)，比較AR基因型及各等位基因頻率分布，分析AR基因CAG微衛(wèi)星多態(tài)與PCOS高雄激素血癥之間的關(guān)系；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)檢測(cè)分析rs6152G/A多態(tài)，比較rs6152G/A基因型和等位基因頻率分布特點(diǎn)及其與PCOS高雄激素血癥之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.AR基因外顯子1 rs6152G/A多態(tài)存在G和A兩種等位基因和GG和GA

13、，AA三種基因型。
　　 2.G和A兩種等位基因頻率在PCOS和對(duì)照組分別為88.4％，11.6％和92.8％、7.2％，GG和GA+AA兩組基因型頻率在PCOS組和對(duì)照照組分別為82.6％、17.4％和89.2％、10.8％，兩組基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.023)；兩組基因型頻率分布差異也有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.043)。
　　 3.與GG純合子相比較，攜帶A等位基因的個(gè)體患PCOS的危險(xiǎn)性增加1.608倍，95

14、％的可信區(qū)間為1.008—2.597(P<0.05)。
　　 4.與對(duì)照組比較，PCOS患者AR基因(CAG)n重復(fù)多態(tài)雙等位基因平均長(zhǎng)度有變短的趨勢(shì)(22.65±2.5 vs23.09±2.1)，PCOS組短組CAG(n=22)頻率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(56.25％vs29.14％，P<0.001)。
　　 5.在PCOS患者中，與高雄激素血癥組比較，非高雄激素血癥雙等位基因的平均長(zhǎng)度和長(zhǎng)組CAG(n>22)的平

15、均長(zhǎng)度明顯短(22.3±2.5 vs23.9±2.2，P=0.008；24.3±1.4 vs25.9±1.6，P=0.005)。
　　 6.在PCOS患者中，方差分析顯示CAG(n<22)，CAG(n=22)和CAG(n>22)三種長(zhǎng)度與雄激素水平明顯相關(guān)(F=3.121，P=0.048)。
　　 結(jié)論：
　　 1.rs6152G/A多態(tài)基因型和等位基因頻率分布與中國(guó)漢族PCOS人群明顯相關(guān)，rs6152A等位基

16、因的攜帶者是PCOS高危人群。
　　 2.中國(guó)漢族人群CAG微衛(wèi)星多態(tài)與PCOS和高雄激素血癥均明顯相關(guān)，可能是PCOS及高雄激素血癥的主要致病因素。
　　 目的：探討TNF-α在多囊卵巢綜合征慢性炎癥中的作用。
　　 方法：于2007年6月至2008年10月收集PCOS肥胖和非肥胖患者血樣和卵泡液標(biāo)本各30例，對(duì)照組肥胖和非肥胖患者血樣和卵泡液標(biāo)本各30例。分離血清和單核細(xì)胞，ELISA分析血清TNF-α水平；

17、提取單核細(xì)胞RNA，總蛋白和核蛋白。分離卵泡液和顆粒細(xì)胞，提取顆粒細(xì)胞的RNA。RT-PCR檢測(cè)單核細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)水平和顆粒細(xì)胞IRS1和IRS2的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)單核細(xì)胞NFκB和IκB的蛋白表達(dá)水平并采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析NFκB結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：與對(duì)照非肥胖組比較，PCOS肥胖和非肥胖組血清TNF-α水平，單核細(xì)胞TNF-α的mRNA的表達(dá)，NFκB的蛋白表達(dá)，PCOS組NF

18、κB的結(jié)合活性明顯增高(P<0.05)；而IRS1的mRNA表達(dá)下調(diào)， IκB蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IRS2的mRNA表達(dá)水平未明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.PCOS血清TNF-α水平明顯提高和單核細(xì)胞TNF-αmRNA的高表達(dá)，NFκB蛋白高表達(dá)，NFκB結(jié)合活性明顯提高，IκB蛋白的低表達(dá)，提示PCOS存在慢性低度炎癥反應(yīng)。
　　 2.PCOS顆粒細(xì)胞IRS1的表達(dá)明顯下