FANCF基因沉默通過激活JNK和p38通路增加了乳腺癌細胞對米托蒽醌的敏感性.pdf

1、前言：
　　 乳腺癌是嚴重威脅女性生命和生活質量的惡性腫瘤,化療藥物由于可以延長患者生存期及改善預后,其臨床療效受到認可,但治療過程中出現(xiàn)的腫瘤耐藥性或腫瘤復發(fā)限制了化療藥物的臨床應用,受到廣泛研究和關注。
　　 范可尼貧血蛋白(FA)作為FA/BRCA通路的重要組分,參與細胞增殖、周期、凋亡和侵襲力等生長表型以及基因轉錄和基因組穩(wěn)定性等生命信號轉導調控,影響腫瘤細胞對DNA損傷劑的敏感性。其中FANCF作為銜接蛋白,是

2、穩(wěn)定FA復合體及FA/BRCA通路生物學功能的關鍵因子。在卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌及神經膠質瘤細胞中發(fā)現(xiàn),FANCF基因啟動子甲基化或者siRNA引起的FANCF蛋白低表達會引起FANCD2泛素化失活、FA/BRCA通路功能缺失從而增加腫瘤細胞對DNA交聯(lián)劑等抗腫瘤藥物的敏感性,但相關研究在乳腺癌中未見報道。
　　 故本研究通過FANCF基因沉默干預FA/BRCA通路功能,檢測乳腺癌細胞生物學行為及對藥物敏感性變化,并探討可

3、能機制。旨在研究并發(fā)現(xiàn)能夠有效增加乳腺癌細胞對藥物敏感性的有效因子或手段,為逆轉乳腺癌細胞耐藥性、提高臨床治療效果,提供實驗室數據。
　　 實驗方法：
　　 乳腺癌MCF-7和T-47D細胞中脂質體法轉染FANCF-shRNA/control-shRNA:MTT法、AnnexinV/PI雙染法、彗星實驗、JC-1染色法分別檢測細胞增殖、凋亡、DNA損傷及線粒體膜電位的變化;采用流式細胞儀檢測細胞內MX蓄積量變化;并用We

4、sternblot檢測FANCF、FANCD2、BCRP/LRP/P-gp/MRP等多藥耐藥蛋白、p53、MAPK通路及凋亡通路上相關蛋白表達情況。
　　 實驗結果：
　　 1.乳腺癌MCF-7和T-47D細胞中轉染FANCFshRNA和controlshRNA不同時間點(24h和48h)后,和controlshRNA組相比,轉染FANCFshRNA24h和48h后兩株細胞中FANCF蛋白表達及FANCD2泛素化水平均明

5、顯降低,且在轉染48h后降低更明顯。在生物學特性方面,和controlshRNA組相比,轉染FANCFshRNA24h和48h后兩株細胞中細胞增殖受抑、凋亡及DNA損傷均增加,其中在轉染48h后增加更明顯;并且在p53突變型的T-47D細胞增加更明顯(P＜0.05),這可能與p53突變的T-47D細胞DNA穩(wěn)定作用差,加之FANCF沉默后導致FA/BRCA通路活化受抑進而使進一步加重DNA不穩(wěn)定性相關。
　　 2.FANCF沉默

6、的乳腺癌MCF-7和T-47D細胞經10μM米托葸醌(MX)處理24h后,與controlshRNA+MX組相比,兩株細胞內MX蓄積量均明顯增加,而且MCF-7細胞中增加更明顯。對多藥耐藥蛋白BCRP/MRP/P-gp等的檢測發(fā)現(xiàn),BCRP在尼FANCFshRNA+MX組中較MX組表達降低;其中在p53野生型的MCF-7細胞中降低更明顯(P＜0.05),MRP、P-gP、LRP表達未見變化。即說明FANCF沉默后MCF-7細胞對MX敏感

7、性增加更明顯。
　　 3.MCF-7和T-47D細胞中FANCF沉默后未見MAPK通路的JNK、ERK、p38蛋白表達發(fā)生變化,但是在10μM的MX作用下,FANCF沉默可以使MCF-7和T-47D細胞中INK和p38蛋白表達及磷酸化水平增加,且明顯高于MX單獨對JNK和p38蛋白表達的增加作用,ERK蛋白表達無變化。P38抑制劑和JNK抑制劑預處理MCF-7和T-47D細胞發(fā)現(xiàn),p38抑制劑預處理可使BCRP表達恢復,JNK抑

8、制劑預處理對BCRP表達未見影響。
　　 4.MX可增加FANCF沉默的p53野生型MCF-7乳腺癌細胞中p53磷酸化水平,而在p53變異型T-47D乳腺癌細胞則增加不明顯,說明FANCF沉默后p53被激活,但對p53變異型T-47D乳腺癌細胞作用較弱;用JNK抑制劑SP600125預處理后,p53表達被完全抑制;用p38抑制劑SB203580預處理后,p53表達被部分抑制。
　　 5.MX可使FANCF沉默后的乳腺癌M

9、CF-7和T-47D細胞線粒體膜電位(△Ψm)下降,而且在MCF-7細胞中下降明顯;同時發(fā)現(xiàn),MX作用于FANCF沉默的MCF-7和T47D細胞質中cyt-c表達明顯增加。進一步發(fā)現(xiàn)caspase-9活化及PARP剪切,MCF7-細胞中caspase-6(因為caspase-3在MCF7細胞中表達缺失,所以用caspase-6代替[38])和T-47D細胞中caspase-3活化,并且在p53野生型MCF-7乳腺癌細胞中較明顯,且發(fā)現(xiàn)兩

10、株細胞中caspase-8均無變化。
　　 結論：
　　 1.FANCFshRNA可使乳腺癌MCF-7和T-47D細胞中FANCF沉默,通過增殖抑制、誘導凋亡及DNA損傷等途徑發(fā)揮阻滯FA/BRCA通路的作用。
　　 2.FANCF沉默誘導MX激活乳腺癌MCF-7和T-47D細胞中MAPK通路的JNK和p38途徑;其中p38途徑激活選擇性抑制了BCRP表達,進而調控細胞耐藥;INK途徑激活對BCRP表達沒有調控作