沉默HK2基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞放療敏感性影響的體外研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)利用乳腺癌體外細(xì)胞模型，探討短發(fā)夾RNA（shRNA）介導(dǎo)的己糖激酶2（hexokinase2, HK2）基因沉默是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性和放療效果有影響。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建己糖激酶-2（HK2）低表達(dá)的穩(wěn)定的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株，然后利用構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株觀察利用shRNA干擾技術(shù)使HK2基因表達(dá)水平降低與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。
　　方法：

2、>　　利用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾技術(shù)設(shè)計(jì)3個(gè)沉默HK2的shRNA基因序列（h-HK2 shRNA1、h-HK2 shRNA2、h-HK2 shRNA3）以及一個(gè)陰性對(duì)照序列(Negative shRNA)，將3沉默序列及一個(gè)陰性對(duì)照序列分別與質(zhì)粒連接，然后轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞，將靶基因植入慢病毒載體，隨后轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系，通過(guò)抗生素嘌呤霉素篩選獲得HK2低表達(dá)的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系。采用R

3、T-PCR及western blotting方法分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的沉默效果。篩選出沉默效果最佳的穩(wěn)定細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3組：空白組（Control組，即不做任何處理），陰性對(duì)照組（Negative組，即轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組）以及沉默的實(shí)驗(yàn)組（HK2 shRNA組，即轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默HK2基因質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組）。
　　1、將上述三組不同的細(xì)胞分別置于0、2、4、6、8Gy劑量的X線(xiàn)下照射，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察三組

4、細(xì)胞在上述不同劑量下的細(xì)胞增值情況。
　　2、將上述三組細(xì)胞在6Gy劑量的X線(xiàn)下照射，然后利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)三組細(xì)胞在6 Gy X線(xiàn)照射下細(xì)胞的凋亡情況。以此來(lái)判斷沉默HK2與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建帶有沉默HK2基因序列pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的質(zhì)粒。
　　2、RT-PCR及 western blot結(jié)果顯

5、示：三個(gè)沉默 HK2的序列中，h-HK2-shRNA1基因序列沉默的效果最好，沉默后HK2的mRNA相對(duì)表達(dá)量下降了89%。
　　3、三組細(xì)胞分別在0、2、4、6、8Gy的 X線(xiàn)照射后，三組細(xì)胞的存活率在同一個(gè)劑量下h-HK2-shRNA1組要明顯低于Control組和Negative組(P<0.05)；并且，隨著照射劑量的逐漸增高，三組細(xì)胞的存活率也逐漸下降，且 h-HK2-shRNA1組下降的幅度更大。
　　4、流式細(xì)胞

6、術(shù)結(jié)果顯示：三組細(xì)胞在6Gy的X線(xiàn)照射下，凋亡率分別為Control組（29.1%），Negative組（29.4%）和 h-HK2-shRNA1組（59.9%），可以看出h-HK2-shRNA1組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其余兩組，且P<0.05。
　　結(jié)論：
　　利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)有效的降低的乳腺癌細(xì)胞中HK2的表達(dá)水平，并成功的構(gòu)建了帶有沉默HK2基因序列的質(zhì)粒，進(jìn)而感染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)