沉默HK2基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞放療敏感性影響的體外研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  本實(shí)驗(yàn)利用乳腺癌體外細(xì)胞模型,探討短發(fā)夾RNA(shRNA)介導(dǎo)的己糖激酶2(hexokinase2, HK2)基因沉默是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性和放療效果有影響。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建己糖激酶-2(HK2)低表達(dá)的穩(wěn)定的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株,然后利用構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株觀察利用shRNA干擾技術(shù)使HK2基因表達(dá)水平降低與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。
  方法:

2、>  利用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾技術(shù)設(shè)計(jì)3個(gè)沉默HK2的shRNA基因序列(h-HK2 shRNA1、h-HK2 shRNA2、h-HK2 shRNA3)以及一個(gè)陰性對(duì)照序列(Negative shRNA),將3沉默序列及一個(gè)陰性對(duì)照序列分別與質(zhì)粒連接,然后轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞,將靶基因植入慢病毒載體,隨后轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系,通過(guò)抗生素嘌呤霉素篩選獲得HK2低表達(dá)的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系。采用R

3、T-PCR及western blotting方法分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的沉默效果。篩選出沉默效果最佳的穩(wěn)定細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3組:空白組(Control組,即不做任何處理),陰性對(duì)照組(Negative組,即轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組)以及沉默的實(shí)驗(yàn)組(HK2 shRNA組,即轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默HK2基因質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組)。
  1、將上述三組不同的細(xì)胞分別置于0、2、4、6、8Gy劑量的X線(xiàn)下照射,通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察三組

4、細(xì)胞在上述不同劑量下的細(xì)胞增值情況。
  2、將上述三組細(xì)胞在6Gy劑量的X線(xiàn)下照射,然后利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)三組細(xì)胞在6 Gy X線(xiàn)照射下細(xì)胞的凋亡情況。以此來(lái)判斷沉默HK2與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。
  結(jié)果:
  1、成功構(gòu)建帶有沉默HK2基因序列pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的質(zhì)粒。
  2、RT-PCR及 western blot結(jié)果顯

5、示:三個(gè)沉默 HK2的序列中,h-HK2-shRNA1基因序列沉默的效果最好,沉默后HK2的mRNA相對(duì)表達(dá)量下降了89%。
  3、三組細(xì)胞分別在0、2、4、6、8Gy的 X線(xiàn)照射后,三組細(xì)胞的存活率在同一個(gè)劑量下h-HK2-shRNA1組要明顯低于Control組和Negative組(P<0.05);并且,隨著照射劑量的逐漸增高,三組細(xì)胞的存活率也逐漸下降,且 h-HK2-shRNA1組下降的幅度更大。
  4、流式細(xì)胞

6、術(shù)結(jié)果顯示:三組細(xì)胞在6Gy的X線(xiàn)照射下,凋亡率分別為Control組(29.1%),Negative組(29.4%)和 h-HK2-shRNA1組(59.9%),可以看出h-HK2-shRNA1組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其余兩組,且P<0.05。
  結(jié)論:
  利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)有效的降低的乳腺癌細(xì)胞中HK2的表達(dá)水平,并成功的構(gòu)建了帶有沉默HK2基因序列的質(zhì)粒,進(jìn)而感染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)

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