先天性心臟病室間隔缺損相關基因Pax-8的實驗研究.pdf

1、目的：在心臟特異的骨形態(tài)形成蛋白受體IA(thebonemorphogeneticproteinreceptorIA，又名ALK3)基因敲除小鼠模型中，純合子的心臟特異ALK3基因敲除的小鼠死于胚胎中期，同時伴有室間隔缺損。但是，ALK3不是心臟的特異基因，為了探索室間隔缺損的特異相關基因，使用基因芯片(microarray)的方法篩選了ALK3下游基因-轉錄因子Pax-8。運用Pax-8基因敲除的小鼠動物模型，以發(fā)現(xiàn)Pax-8基因敲除

2、后小鼠心臟發(fā)育和功能的異常。 方法：取正常雌雄C57小鼠交配后的孕9.5天，10.5天，11.5天，12.5天以及13.5天的小鼠胚胎心臟提取總RNA，運用實時熒光定量RT-PCR法檢測Pax-8基因在正常小鼠胚胎中的表達情況。雌的α-MHCCre+/-，ALK3+/-和雄的ALK3F/F(在ALK3基因第二外顯子兩邊插入LoxP的片段)交配可獲得α-MHCCre+/-，ALK3F/-(純合子)和α-MHCCre+/-，ALK3

3、F/+(雜合子)的小鼠胚胎，運用原位雜交法顯示Pax-8基因在小鼠胚胎心臟中的表達部位。雌的Pax-8KO+/-和雄的Pax-8KO+/-交配可獲得Pax-8KO-/-(純合子)和Pax-8KO+/-(雜合子)，TUNEL法可以檢測心肌細胞在不同實驗組的凋亡情況，同時電鏡下觀察Pax-8基因敲除的小鼠心臟組織發(fā)育的病理學異常。 結果：熒光定量RF-PCR結果顯示，正常孕9.5天，10.5天，11.5天，12.5天以及13.5天的

4、胚胎小鼠心臟中的Pax-8基因的表達水平以10.5天最高，12.5天表達為最低。同時原位雜交顯示Pax-8基因表達在α-MHCCre+/-，ALK3F/+(雜合子)13.5天的小鼠胚胎的心臟，但不能在13.5天α-MHCCre+/-，ALK3F/-(純合子)小鼠心臟中顯示。對Pax-8基因敲除小鼠的心臟的研究顯示其表現(xiàn)出晚期心功能不全的形態(tài)改變，光鏡下Pax-8KO-/-(純合子)心臟四腔心切片HE染色后形態(tài)與Pax-8KO+/-(雜合

5、子)比較，Pax-8KO-/-心臟成球形，左心室腔擴大，左心室壁肥厚，室間隔增厚，左室乳頭肌肥大，Pax-8KO+/-小鼠心臟形態(tài)尚正常。透射電鏡下Pax-8KO-/-小鼠心肌左心室壁以及室間隔組織的肌絲肌節(jié)排列尚整齊，肌漿網(wǎng)擴張，可見大量的凋亡心肌細胞，凋亡程度較重，細胞染色質濃集和邊移，形成凋亡小體，細胞固縮而細胞膜完整，胞漿空泡，線粒體數(shù)量明顯增多，體積明顯減小。Pax-8KO+/-小鼠心肌左心室和室間隔組織肌絲肌節(jié)排列尚整齊，肌

6、漿網(wǎng)未見明顯擴張，可見中等量的凋亡心肌細胞，線粒體大小數(shù)量未見明顯異常。野生型C57小鼠肌絲肌節(jié)排列尚整齊，肌漿網(wǎng)未見明顯擴張，可見極少量的凋亡心肌細胞，線粒體大小形態(tài)正常。TUNEL法測定心肌細胞凋亡率結果顯示，Pax-8KO-/-(純合子)心肌細胞凋亡率為50.6932±5.36665％,Pax-8KO+/-(雜合子)心肌細胞凋亡率25.4724±5.61390％,C57野生型小鼠心肌細胞凋亡率為2.9472±0.64102％。