先天性心臟病間隔缺損GATA-4基因突變及功能分析.pdf

1、目的：探討先天性房、室間隔缺損患者GATA-4基因突變情況以及其基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系；研究漢族先天性房、室間隔缺損患者GATA-4基因兩個突變點的功能。 方法：選擇50例漢族先天性房、室間隔缺損患者和100例漢族健康者，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增GATA-4基因6個外顯子編碼區(qū)及兩側(cè)各50個堿基以上的序列，PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI PRISM3730全自動DNA測序儀自動測序，然后與NCBI數(shù)據(jù)庫中GATA-4基因的

2、序列進行比對，并與健康對照組比較，觀察GATA-4基因突變情況；利用生物信息學(xué)方法預(yù)測GATA-4基因點突變對其蛋白結(jié)構(gòu)和功能影響；以野生型pcDNA3.1-GATA-4為模板，用基因定點突變的方法構(gòu)建突變型真核表達載體；在體外和ANF luciferase報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細胞，48小時后檢測下游ANF-Luciferase報告基因的活性。 結(jié)果：⑴找到GATA-4基因三個多態(tài)性位點。除了在第2號外顯子上第196位核苷酸發(fā)

3、現(xiàn)存在G→A轉(zhuǎn)換(c. G196A)，導(dǎo)致相應(yīng)的第66位的丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)取代(Ala66Thr)，而SNP庫報道rs1139244第196位核苷酸G→C顛換(c.G196C)，導(dǎo)致相應(yīng)的第66位的丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)取代(Ala66Pro)以外，rs1062215和rs804280二個多態(tài)性位點基因型與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中報道的完全一致。⑵發(fā)現(xiàn)GATA-4基因兩個新的雜合子突變，分別位于第2號外顯子

4、的His28Tyr和位于第7號外顯子的His436Tyr，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中均未見報道且在100例對照組中也未發(fā)現(xiàn)。⑶GATA-4基因編碼第28位和第436位組氨酸在生物進化過程中均處于高度保守。⑷SIFT和PolyPhen程序預(yù)測GATA-4基因His28Tyr和His436Tyr兩個點突變都可能影響它的蛋白質(zhì)功能。⑸PcDNA3.1-GATA-4突變型真核表達質(zhì)粒經(jīng)正反兩個方向進行測序驗證構(gòu)建成功。⑹GATA-4基因His2

5、8Tyr突變型質(zhì)粒激活下游ANF luciferase報告基因的活性與野生型GATA-4質(zhì)粒相比是(112±6.9)％，沒有顯著性差異(P>0.05)；而GATA-基因His436Tyr突變型質(zhì)粒激活下游ANF luciferase報告基因的活性明顯下降，與野生型GATA-4質(zhì)粒相比是(53.8±6.6)％，具有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：①轉(zhuǎn)錄因子GATA-4基因突變可能與漢族先天性房、室間隔缺損發(fā)生有關(guān)。②PcDNA