玉米全基因組抗病侯選基因的克隆和定位.pdf

1、本研究應(yīng)用從已知抗病基因最常見(jiàn)的保守結(jié)構(gòu)域NBS上設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，通過(guò)改良的AFLP和3'RACE方法分別從玉米基因組DNA和cDNA中擴(kuò)增抗病基因同源體(resistancegeneanalogs，RGA)；同時(shí)利用公布的玉米EST數(shù)據(jù)庫(kù)，利用已知抗病基因的全長(zhǎng)序列，采用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(datamining)的方法，分離抗病基因同源ESTs(R-gene-likeESTs)；然后，將獲得的抗病基因相關(guān)序列定位到玉米基因組上構(gòu)建連鎖圖譜，具

2、體結(jié)果如下： 將AFLP方法和NBS簡(jiǎn)并引物相結(jié)合發(fā)展改良的AFLP方法，擴(kuò)增玉米基因組DNA上抗病基因同源序列。以64個(gè)AFLP選擇性擴(kuò)增引物和NBS簡(jiǎn)并引物組成引物對(duì)，擴(kuò)增得到大量的DNA片段，經(jīng)過(guò)回收、克隆和測(cè)序，得到的285個(gè)非冗余的序列，通過(guò)在GenBank中Blast驗(yàn)證，有23個(gè)屬抗病基因同源序列，所占的比例達(dá)到了8％以上。 用改良3'RACE方法，以cDNA為模板，用RACE試劑盒所帶的upm引物和NBS

3、簡(jiǎn)并引物組合擴(kuò)增RGAs，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5kb、0.75kb和0.5kb為主帶呈連續(xù)分布。選擇1.5-2.0kb擴(kuò)增產(chǎn)物切割回收并克隆，測(cè)序得到的246個(gè)非冗余的序列，有12個(gè)是抗病基因同源序列，約占5％。 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索(Datamining)鑒別抗病基因同源ESTs：迄今為止，玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST數(shù)量已經(jīng)超過(guò)了55萬(wàn)，試驗(yàn)證明覆蓋了玉米基因組的大部分表達(dá)區(qū)域。通過(guò)在MaizGDB和GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中的檢索、驗(yàn)證、再檢索反復(fù)

4、三次Blast，總共得到185個(gè)抗病基因同源ESTs，其中有110抗病基因同源的Unigenes和75抗病基因同源SingletonESTs。在這185個(gè)抗病基因同源的Unigenes或SingletonEST中，有66個(gè)其推導(dǎo)的編碼產(chǎn)物含有NBS-LRR結(jié)構(gòu)域，有59個(gè)其推導(dǎo)的編碼產(chǎn)物含有LRR結(jié)構(gòu)域，有60個(gè)其推導(dǎo)的編碼產(chǎn)物含有PK或PK/PK結(jié)構(gòu)域。 發(fā)展基因標(biāo)簽標(biāo)記定位所獲得的抗病基因相關(guān)序列：根據(jù)RGAs的序列設(shè)計(jì)引物

5、從豫玉22號(hào)的兩親本‘87-1’和‘綜3’中擴(kuò)增抗病基因相關(guān)序列，再根據(jù)序列多態(tài)性發(fā)展STS、CAPS和SNP等基因標(biāo)簽標(biāo)記，總共發(fā)展了53個(gè)RGAs的基因標(biāo)簽標(biāo)記。以豫玉22號(hào)的第10代293個(gè)重組自交系(RIL)為定位群體檢測(cè)發(fā)展的基因標(biāo)簽標(biāo)記在定位群體上的帶型數(shù)據(jù)。用Mapmaker3.0作圖軟件將這些RGAs整合到豫玉22號(hào)高密度SSR標(biāo)記連鎖圖譜上構(gòu)建了玉米抗病相關(guān)基因連鎖圖譜。有48個(gè)RGAs定位到連鎖圖的49個(gè)位點(diǎn)(其中R