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文檔簡介
1、隨著老齡化的增加,骨質疏松的發(fā)病率逐年增加。骨質疏松是一種多病因的病理性改變,以單位體積內骨組織量的減少、骨小梁結構破壞為特征,可引起骨脆性增加及易于骨折的全身代謝性疾病。由于骨脆性增加,輕微外力便可導致骨折。目前隨著交通的發(fā)展及老年人社會活動的增加,老年性骨折的特點發(fā)生很大變化,除常見輕微外力造成的干骺部骨折外,暴力造成的骨干骨折的發(fā)生率明顯增加。由于骨質疏松導致的骨骼質量下降,骨折周圍軟組織的損傷等因素,骨不連發(fā)生率明顯增加。目前對
2、骨質疏松骨折骨不連的研究甚少,尚未見關于骨質疏松骨折骨不連模型建立的報道。
本研究通過建立骨質疏松模型,進一步建立骨質疏松骨不連模型,并通過骨不連斷端影像學和組織學觀察,確定骨不連模型的建立。待模型建成后,對骨折斷端加壓,進一步對骨不連骨斷端成骨因子(BMP、VEGF、TGF)測定,并進行影像學和組織學觀察,與骨不連模型比較,得出骨質疏松骨折骨不連斷端機械應力有利于骨折愈合,為機械性應力作用于骨斷端促進骨折愈合提供相應的理論依
3、據。
主要實驗方法及結果
1.骨質疏松模型的建立實驗組(OVX組):將6月齡雌性SD大鼠,用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉成功后,背部剪毛,碘伏消毒術野,鋪洞巾,自雙側肋脊角外下各1cm處縱形切口,逐層分離,打開腹腔,視野中可見一乳白色的脂肪團,卵巢即包埋其中,以小鑷子輕輕夾住脂肪團拉出切口外,分離脂肪團,可見粉紅色豆粒大小的卵巢。剪取時,先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用手術線結扎,再摘除卵巢,術
4、后順勢將子宮送回腹腔中,同法摘除另一側卵巢。慶大霉素注射液0.3mL(4萬u/mL)+生理鹽水0.6mL(1∶2)沖洗切口,關閉腹腔。
對照組(SHAM組):將6月齡雌性SD大鼠,用10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉成功后僅切除卵巢附近與之等量的脂肪組織。術后所有大鼠肌注青霉素,持續(xù)3天,以預防感染。標準飲食,常規(guī)分籠飼養(yǎng)3月后將實驗組與對照組老鼠處死,通過骨密度、血清學檢測、大鼠體重及股骨濕重、干重、灰重的
5、測定等指標鑒定骨質疏松。
2.骨質疏松骨折骨不連模型建立骨質疏松大鼠模型建立后,所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,手術區(qū)用碘伏消毒,鋪單,以股骨中段為中心,沿股骨長軸做縱行切口,切開皮膚,沿肌間隙鈍性分離至股骨表面,盡量保留骨膜,先自小轉子與第三轉子之間依次鉆孔,然后自股骨髁遠端向近端方向,依次鉆孔,打入帶螺紋的克氏針,環(huán)形線鋸截斷股骨,將四根克氏針套入自制可調節(jié)加壓式外固定架(圖5),調整斷端距離d
6、=6mm,并使擰緊螺絲,用生理鹽水沖洗斷端髓腔,逐層縫合,術后青霉素肌肉注射,連續(xù)3天,分籠飼養(yǎng)12周。
2.1 X線檢查:
在0、2、4、8、10、12周觀察骨折斷端無連續(xù)性骨痂形成,到術后12周時影像學顯示骨折斷端髓腔骨性封閉,兩斷端處于同一水平面上,外固定支架穩(wěn)定。
2.2 HE染色:
術后2周斷端周圍少量細胞核深染的成骨樣細胞,周圍有大量的炎癥反應細胞;術后4周,斷端周圍成骨樣細胞增多,并
7、出現(xiàn)一定數(shù)量的軟骨細胞,斷端之間充滿大量炎性細胞;術后8周,斷端周圍有少量細胞核深染的成骨樣細胞及大量肥大軟骨樣細胞,斷端之間出現(xiàn)大量梭形、橢圓形的成纖維細胞;術后10周,斷端出現(xiàn)大量不規(guī)則的編織樣骨;術后12周,斷端髓腔封閉,周圍分布少量成骨細胞,斷端見大量梭形的成纖維細胞。
3.骨質疏松骨折骨不連斷端機械應力實驗實驗組(加壓組):如圖5所示,螺帽1可自由滑動,有固定滑塊2的作用,從而維持活動塊2與3之間的固定距離。在加壓的
8、第1個月,調節(jié)螺旋桿,通過特定的卡尺計量并縮短2mm的距離,每天通過食物刺激的方法誘使大鼠高強度活動。每次持續(xù)10分鐘,間歇30分鐘,每天10個循環(huán)。加壓的第2個、第3個月,均在原來基礎上縮短2mm,加壓方法同前所述。對照組:調節(jié)螺帽1,固定滑塊2,維持2、3之間的距離在三個加壓時間點內保持不變(d=6mm),其它方法同上所述。
3.1 X線檢查對照組:在4、8、12周觀察骨不連斷端無骨痂生成,間隙仍然存在,斷端呈杵棒樣改變。
9、
實驗組:加壓后4周,隨著斷端間隙縮短,斷端間隙呈模糊狀改變,部分釘?shù)乐車泄悄は鲁晒切纬?加壓后8周骨折斷端間隙出現(xiàn)絮狀模糊影,部分樣本在單側皮質間有新骨形成;12周時斷端間隙縮短,呈模糊狀改變,或出現(xiàn)一側的骨性連接,或單側明顯的成骨反應,與加壓后4周、對照組比較有顯著差異(p<0.05);12周影像學評分較前兩次、對照組有顯著差異(p<0.05)。
3.2 加壓4、8、12周后,行免疫組化染色對照組:在4、8、1
10、2周時骨不連斷端BMP、VEGF、TGFβ仍有表達,但無峰值變化,呈低表達狀態(tài)。
實驗組(加壓組):加壓后4周,BMP、VEGF、TGFβ陽性表達增多,到加壓后8周,BMP陽性表達顯著增多,VEGF、TGFβ呈持續(xù)表達;12周時TGFβ陽性表達增多。
①.BMP:加壓后4周,BMP局部表達明顯高于對照組(p<0.05),到8周時,其表達出現(xiàn)短暫的峰值,與前后兩次測量比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05);到12周時,其表達
11、量下降,但仍高于對照組(p<0.05)。
?、?VEGF;加壓早期出現(xiàn)高峰,較后兩次測量值比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。8周、12周其表達量無明顯差異,但均高于對照組測量值(p<0.05)。
?、?TGFβ檢測:加壓后其表達量高于對照組(p<0.05),但組內前后三次測量值相比較無統(tǒng)計學差異。
3.3 鈣鈷法堿性磷酸酶染色:
對照組:在4、8、12周骨不連斷端仍有一定數(shù)量的成骨細胞表達,但其數(shù)量較
12、少。
實驗組:加壓4周后局部成骨細胞數(shù)量明顯增多,較對照組變化明顯(p<0.05),第8周時呈上升趨勢,與前后兩個時期比較統(tǒng)計學差異明顯(p<0.05);到12周時,成骨細胞數(shù)量降低。
3.4 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)機械性應力作用下,BMP、VEGF在不同時期的的基因擴增明顯高于對照組(p<0.05); VEGF基因擴增在加壓后4周出現(xiàn)峰值,較8周、12周差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05;圖8-3)
13、;BMP基因擴增在加壓后8周出現(xiàn)峰值,較4、12周差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05;圖7-3);而TGFβ在三個加壓期無明顯上升趨勢,仍高于對照組(p<0.05;圖9-3)
結論:
1.通過應用自制的可調式外固定支架,可建成骨質疏松骨折骨不連模型。
2.骨質疏松骨折骨不連局部存在相應的成骨因子,但呈低表達狀態(tài)。
3.機械應力作用可增加骨質疏松骨折骨不連斷端相應成骨因子的表達。
4.組織學觀
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