骨保護素基因多態(tài)性及骨質(zhì)疏松性骨折的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)的主要表現(xiàn)為骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨皮質(zhì)較正常變薄，骨小梁數(shù)目少于平常水平，骨髓腔擴大，容易導致骨質(zhì)疏松性骨折。骨質(zhì)疏松性骨折臨床上以脊柱椎體壓縮性骨折，橈骨遠端骨折等多見，引起駝背，身體縮短以及呼吸系統(tǒng)的疾病，常常需要較長時間臥床修養(yǎng)，嚴重影響病人的生活質(zhì)量，甚至并發(fā)褥瘡，肺內(nèi)感染，泌尿系感染等疾病，威脅患者的生命，故亟需進一步研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制以

2、及骨質(zhì)疏松性骨折的愈合機制。
　　針對以上問題，本文將研究了骨保護素(osteoprotegerin，OPG)遺傳多態(tài)性與骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）和骨質(zhì)疏松的相關性，OPG基因突變對蛋白表達和生物活性的影響及其影響破骨細胞分化成熟的信號轉(zhuǎn)導機制，以期進一步了解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制，研究了骨質(zhì)疏松性骨折與血清神經(jīng)生長因子相關性，并探討了神經(jīng)生長因子促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合的可能機制，為骨質(zhì)疏松及其

3、骨質(zhì)疏松性骨折的治療提供支持。具體的研究包括以下幾個方面:
　　(1)研究了骨保護素基因g.27563G＞A遺傳多態(tài)性與絕經(jīng)女性骨密度關系的問題。骨質(zhì)疏松的主要表現(xiàn)為骨密度降低，骨小梁的數(shù)目減少，骨皮質(zhì)變薄，髓腔增寬，容易導致骨質(zhì)疏松性骨折。研究納入435名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性和442名年齡相仿的健康女性為對照進行病例對照研究。用美國NORLAND公司XR-46型雙能X線骨密度儀評估髖股骨頸、腰椎(L2-4)和全髖關節(jié)骨礦物質(zhì)密度。

4、應用創(chuàng)造酶切位點聚合酶鏈式反應(CRS-PCR)和DNA測序方法檢測g.27563G＞A骨保護素遺傳多態(tài)性基因型。我們發(fā)現(xiàn)g.27563G＞A骨保護素遺傳多態(tài)性為錯義突變，導致了精氨酸（Arg）至谷氨酰胺(Gln)的氨基酸(p.Arg333Gln)置換。骨保護素g.27563G＞A遺傳多態(tài)性基因型髖股骨頸、腰椎（L2-4）和全髖關節(jié)骨礦物質(zhì)密度明顯不同。GG基因型的骨礦物質(zhì)密度值明顯高于其他基因型GA和AA(P＜0.05)，故認為骨保護

5、素g.27563G＞A基因遺傳多態(tài)性A等位基因可能與絕經(jīng)后女性骨礦物質(zhì)密度值低相關，從而增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險。
　　(2)研究了OPG基因突變對蛋白表達和生物活性的影響。我們通過CRS-PCR方法在OPG基因第5外顯子發(fā)現(xiàn)g.27563G＞A基因遺傳多態(tài)性，隨后分析了該遺傳多態(tài)性與BMD和骨質(zhì)疏松的潛在關系。結(jié)果顯示中國絕經(jīng)期女性骨密度和骨質(zhì)疏松與遺傳多態(tài)性有顯著相關性。然而，OPG的基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松之間的具體聯(lián)系并不清楚。

6、故本部分在成功構(gòu)建體外過表達野生型和突變型OPG基因的細胞培養(yǎng)體系的基礎上，研究突變對OPG的蛋白表達和活性影響。結(jié)果表明基因突變不能影響OPG的蛋白表達水平，但是能夠抑制其正?；钚?。
　　(3)研究了OPG基因突變影響破骨細胞分化成熟的信號轉(zhuǎn)導機制。我們觀察了野生型和突變型OPG基因所表達的蛋白在破骨細胞的分化與活化功能上是否存在差異。結(jié)果表明野生型OPG能夠抑制破骨細胞的分化，而突變型的OPG抑制作用顯著低于野生型。然而，具體

7、作用機制仍不清楚，需要進一步研究。破骨細胞從起源發(fā)育至成熟，再經(jīng)活化發(fā)揮吸收作用是一個復雜的多級調(diào)控過程，介導破骨細胞分化成熟的信號傳導路徑主要包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)和鈣調(diào)磷酸酶/活化T細胞核因子(CN/NFAT)等通路。本章內(nèi)容將研究OPG基因突變能否影響破骨細胞分化過程中MAPK信號通路和Ca2+信號通路。
　

8、　(4)研究了骨質(zhì)疏松性骨折與血清神經(jīng)生長因子相關性的問題。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是導致骨折。骨強度降低導致骨質(zhì)疏松性骨折，由于屬于脆性骨折，所以輕微的損傷如摔倒、扭傷等即可發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折常發(fā)生于橈骨（遠端骨折）、肱骨（近端骨折）、脊椎（胸腰段）。研究納入102名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折女性，102名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性和102名年齡相仿的健康女性，進行病例對照研究。所有入選對象均抽取空靜脈血5ml，采用雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫吸附法(ELI

9、SA)檢測血清神經(jīng)生長因子(NGF)水平，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折患者與年齡相仿的健康女性相比，血清NGF水平下降(P＜0.05)，說明NGF水平下降可能是導致骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的因素。
　　(5)研究了探討神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)對兔骨折愈合過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)表達的影響。健康新西蘭大耳白兔108只，制備標準的兔右側(cè)橈

10、骨骨折模型，A組采用肌肉注射NGF1周，200ng/Kg/次，一日二次;B組采用腹腔注射NGF抗體三周，400ng/次，一日三次，C組注射生理鹽水三周，1ml/次，一日二次。進行BMP蛋白Western免疫印記分析，Gel Doc2000圖像分析，發(fā)現(xiàn)在各個時相點，NGF組比抗NGF抗體組、對照組誘導骨組織內(nèi)BMP表達量多，且NGF組骨組織中BMP表達時間延長，高峰濃度提前、下降緩慢(P＜0.05)。說明神經(jīng)生長因子促進骨折愈合的機制可

11、能是:通過促進骨折愈合過程中BMP的表達促進骨折愈合。
　　(6)研究了神經(jīng)生長因子對兔骨折愈合過程中血管內(nèi)皮生長因子表達的影響。建立標準兔橈骨骨折模型，分別用神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子單克隆抗體和生理鹽水進行干預，用Western blot免疫印跡分析方法檢測損傷后24，48h和損傷后1，3，6，8周，骨折端組織血管內(nèi)皮生長因子蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)3組各時間點血管內(nèi)皮生長因子表達的關系為:應用神經(jīng)生長因子組＞對照組＞拮抗神經(jīng)生長因子

12、組(P＜0.05)。說明在骨折愈合過程當中，應用神經(jīng)生長因子可以促進血管內(nèi)皮生長因子表達。
　　通過上述研究，發(fā)現(xiàn)骨保護素g.27563G＞A基因遺傳多態(tài)性A等位基因可能與中國絕經(jīng)后女性骨礦物質(zhì)密度值低相關，從而增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險。進一步研究發(fā)現(xiàn)OPG基因突變雖然不影響OPG蛋白表達水平，但能夠抑制其正?；钚裕瑢ζ乒羌毎只挠绊懪cp38和JNK信號通路有密切聯(lián)系。神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織密切相關，可能通過神經(jīng)遞質(zhì)、外周神經(jīng)突觸以及激