唑來(lái)膦酸及其與多西他賽聯(lián)合運(yùn)用對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞體外作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的和研究背景：
　　前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一，在美國(guó)占男性腫瘤死亡率第二位，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率也是逐年升高。前列腺癌是對(duì)雄激素依賴的腫瘤，所以大多數(shù)前列腺癌患者剛開(kāi)始對(duì)于祛除雄激素治療有效，但約50％-60％患者在接受內(nèi)分泌治療后的18-24個(gè)月后會(huì)轉(zhuǎn)變成為激素難治性前列腺癌(Hormonerefractoryprostatecancer，HRPC)。
　　而HRPC患者骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高達(dá)65-75

2、％，骨是最易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織。唑來(lái)膦酸(zoledronicacid，ZOL)是目前唯一被證實(shí)能減少前列腺癌骨轉(zhuǎn)移以及骨相關(guān)事件發(fā)生率，并能持久緩解疼痛的雙磷酸鹽藥物。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸不但能通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的活動(dòng)和增殖，對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移，還有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞)。目前，晚期前列腺癌患者的治療一直是困擾臨床泌尿外科的一個(gè)難題，而唑來(lái)膦酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用的特性，無(wú)疑為臨床治療HRPC患者

3、提供了新的思路，它與目前公認(rèn)的HRPC一線化療藥物多西他賽(docetaxel，DOC)聯(lián)合應(yīng)用能否產(chǎn)生協(xié)同作用更加成為了人們關(guān)注的課題。
　　目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的研究尚處于基礎(chǔ)研究階段。國(guó)外部分研究已證實(shí)，唑來(lái)膦酸主要通過(guò)甲羥戊酸途徑起到抗腫瘤的作用。而對(duì)唑來(lái)膦酸和多西他賽聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)研究則更少。兩者聯(lián)合運(yùn)用于乳腺癌細(xì)胞的研究提示其具有協(xié)同抗腫瘤作用，而對(duì)于前列腺癌的作用在最新的腫瘤學(xué)雜志上也開(kāi)始出現(xiàn)零星的報(bào)道(ActaOnl

4、ocogia)，但資料還是非常有限。
　　本研究的目的正是為進(jìn)一步驗(yàn)證唑來(lái)膦酸對(duì)激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞系的抗腫瘤作用，同時(shí)探討唑來(lái)膦酸與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用于PC-3細(xì)胞是否具有協(xié)同作用，并通過(guò)對(duì)被抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的影響，來(lái)揭示其抗腫瘤作用的可能機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：
　　1.MTT比色法觀察ZOL對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用
　　本部分研究用不同濃度的ZOL(6

5、.25μg/m1-400μg/ml)作用于體外培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞，藥物作用2小時(shí)后，換正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在72小時(shí)后采用噻唑蘭(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，ZOL可以顯著抑制PC-3細(xì)胞的增殖，這種作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。在100μg/ml的濃度下，PC-3細(xì)胞抑制率達(dá)到19.0％，在200μg/ml濃度下抑制率達(dá)到44.5％，而400μg/ml濃度時(shí)則達(dá)到了57.9％。光鏡下觀察到細(xì)胞濃度明顯降低。
　

6、　2.MTT比色法觀察ZOL與DOC聯(lián)合應(yīng)用對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖抑制作用
　　本部分研究采用不同濃度的ZOL(藥物作用2小時(shí))與10ng/ml、100ng/ml濃度下DOC(藥物作用24小時(shí))聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞，換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后采用噻唑蘭(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果表明，ZOL與DOC具有聯(lián)合抑制細(xì)胞增殖的作用，在DOC濃度條件不變情況下，這種增殖抑制作用隨著ZOL藥物濃度的增加而增強(qiáng)

7、。在10ng/ml濃度DOC條件時(shí)，200μg/ml濃度ZOL可抑制49.3％的PC-3細(xì)胞，400μg/ml時(shí)抑制率達(dá)到61.4％：在100ng/ml濃度的DOC條件時(shí)，200μg/ml濃度ZOL的細(xì)胞抑制率達(dá)到59.7％，400μg/ml時(shí)抑制率達(dá)到74.2％。光鏡下細(xì)胞密度明顯降低，且伴有細(xì)胞質(zhì)減少的表現(xiàn)。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3細(xì)胞周期的分布變化
　　本部分研究將PC-3細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，過(guò)夜貼壁后，用

8、不同濃度的ZOL作用2h，換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h。胰酶消化處理后收集離心，放入70％冰乙醇后制成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的自然凋亡率為0.73％，G1、S、G2期的細(xì)胞比例分別是61.2％、36.61％、2.13％。經(jīng)過(guò)400μg/mlZOL處理后的細(xì)胞凋亡率是5.93％，G1、S、G2期的細(xì)胞比例分別是45.71％、48.45％、5.83％。經(jīng)過(guò)ZOL處理后細(xì)胞凋亡增加，

9、而G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增加，G2期細(xì)胞有所增加。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ZOL、DOC作用前列腺癌PC-3細(xì)胞后的細(xì)胞增殖活性觀察以及細(xì)胞周期的分布變化情況，驗(yàn)證了ZOL對(duì)非雄激素依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能使PC-3細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯在S期以及G2期。且這種作用與ZOL的濃度呈正相關(guān)的關(guān)系。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸與多西他賽聯(lián)合作用于PC-3細(xì)胞較唑來(lái)膦酸或者多西他賽