人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系PLA-802細(xì)胞受諾帝（Nordy）的作用以及趨化因子受體CXCR4功能性表達的研究.pdf

1、背景和目的：橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是軟組織最好發(fā)的惡性腫瘤之一，可發(fā)生于任何年齡，惡性程度高，危害較大。近年來，隨著化療等方法的應(yīng)用和改進，RMS的治療得到了一定程度的改善，但療效仍不滿意。積極探索RMS發(fā)生發(fā)展的機理，開發(fā)新的抗RMS藥物對RMS的防治具有重要意義。諾帝(Nordy)是西南醫(yī)院病理所自行研制的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiareticacid，NDGA)類化合物，研究發(fā)現(xiàn)

2、，Nordy對體內(nèi)外生長的肺癌細(xì)胞A549和多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及誘發(fā)性膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制增殖、誘導(dǎo)分化、抑制腫瘤血管生成等多種生物學(xué)作用，提示Nordy可能是一種具有應(yīng)用潛力的新型抗腫瘤藥物。進行Nordy對RMS作用的研究，對Nordy的臨床應(yīng)用和RMS的治療都具有現(xiàn)實意義。趨化因子及其受體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要而復(fù)雜的作用，是腫瘤研究的一個熱點。研究表明多種RMS細(xì)胞系均有趨化因子受體CXCR4的表達，但對人RMS的CXC

3、R4蛋白表達及其功能了解尚少。本課題就Nordy對RMS的作用，以及RMS中CXCR4蛋白表達和功能進行了研究。 材料和方法：研究對象為24例RMS臨床標(biāo)本和PLA-802細(xì)胞系(源自腺泡性RMS)。第一部分：用細(xì)胞計數(shù)法測定IC50和對PLA-802細(xì)胞生長曲線的影響、流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞周期、凋亡的影響、光鏡和電鏡觀察瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化及免疫細(xì)胞化學(xué)染色和ELISA檢測瘤細(xì)胞myosin和VEGF蛋白的表達研究No

4、rdy對PLA-802細(xì)胞的影響。第二部分：將PLA-802細(xì)胞移植于裸鼠皮下建立移植瘤模型，通過腹腔注射給予Nordy治療，測量腫瘤大小變化以確定對移植瘤生長曲線的影響；光鏡和電鏡觀察腫瘤形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響；免疫組化染色和圖像分析檢測對瘤細(xì)胞myosin蛋白表達和VEGF蛋白表達的影響以及微血管密度(MVD)的影響；觀察Nordy在27mg/kg劑量范圍內(nèi)對裸鼠的毒副作用。第三部分：用免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)染色檢測RMS病理標(biāo)本和體

5、內(nèi)外生長的RMS細(xì)胞系PLA-802 CXCR4蛋白表達。第四部分：用MTT法檢測CXCR4對PLA-802細(xì)胞增殖的影響、用體外隨機遷移模型和48孔趨化板檢測CXCR4對PLA-802細(xì)胞遷移和趨化的作用、用激光共聚焦技術(shù)檢測CXCR4對PLA-802細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響及免疫細(xì)胞化學(xué)染色和ELISA實驗檢測CXCR4對PLA-802細(xì)胞VEGF蛋白表達的影響等檢測CXCR4功能。結(jié)果：(1)體外實驗：1)Nordy對PLA-80

6、2細(xì)胞作用的IC50為69.23μmol/L；2)50-～200μmol/L Nordy對PLA-802細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，且具有濃度.時間依賴性；3)Nordy處理后細(xì)胞形態(tài)變梭長，核質(zhì)比降低，核變小，核仁變?。?)Nordy處理24h后電鏡見瘤細(xì)胞線粒體嵴紊亂、斷裂，空化或形成髓鞘樣結(jié)構(gòu)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；72h時細(xì)胞呈橢圓形或梭形；線粒體腫脹減輕，空化減少而髓鞘樣結(jié)構(gòu)增多；胞質(zhì)內(nèi)較易見到含量不等的肌(微)絲；偶

7、見擬似凋亡小體；5)100μmol/L Nordy處理PLA-802細(xì)胞后，12、24h細(xì)胞周期的G0/G1期分別增加了15.1％和8.7％，而48、72h時G2/M期分別增加了3 17.4％和137.2％，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；6)100μmol/L Nordy處理PLA-802細(xì)胞，12h后即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡峰，并隨作用時間的延長而增高，與對照組比較差異顯著(P＜0.05): 7)Nordy處理后瘤細(xì)胞

8、myosin蛋白表達增高，VEGF蛋白表達降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；(2)體內(nèi)實驗：1)13.5mg/kg及27mg/kg Nordy治療組移植瘤生長明顯受抑制(P＜0.05)，抑瘤率：前者為47.43％，后者為60.02％；2)治療組未出現(xiàn)明顯藥物毒副作用；3)治療組瘤細(xì)胞異型性變小，核分裂像減少；血管減少；4)電鏡見治療組瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌(微)絲增多，甚至形成橫紋肌肌原纖維；5)免疫組化染色顯示治療組瘤細(xì)

9、胞myosin蛋白表達增高，VEGF蛋白表達降低，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)。(3)RMS CXCR4蛋白表達檢測：不同病理組織學(xué)類型RMS組織和體內(nèi)外生長的PLA-802細(xì)胞均存在CXCR4蛋白表達，腺泡性RMSCXCR4蛋白表達比胚胎性強(P＜0.05)；(4)RMS細(xì)胞CXCR4功能檢測：1)10、25ng/ml SDF-1α能明顯刺激PLA-802細(xì)胞增殖(P＜0.05)，最佳濃度為10ng/ml SDF-1α：2)4

10、0ng/ml SDF-1α能增強PLA-802細(xì)胞自發(fā)運動的能力(P＜0.05)；SDF-1α能夠誘導(dǎo)PLA-802細(xì)胞發(fā)生趨化運動，在10～100ng/ml的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，達到最大遷移效果的濃度為100ng/ml CXCR4抗體能夠特異抑制SDF-1α誘導(dǎo)的PLA-802細(xì)胞遷移，在1到20μg/ml濃度內(nèi)這種抑制作用呈劑量依賴的關(guān)系，20μg/ml濃度幾乎完全抑制30ng/ml SDF-1α誘導(dǎo)的趨化作用；4)SDF-1

11、α在25～100ng/ml濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系引起PLA-802細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)，其規(guī)律是加入SDF-1α后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，至一定高度后再降低，細(xì)胞外存在或不存在鈣離子的條件下反應(yīng)均相同；5)SDF-1α激活CXCR4后PLA-802細(xì)胞VEGF蛋白表達升高。結(jié)論：①Nordy對PLA-802細(xì)胞具有抑制生長、促進凋亡、影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)分化、抑制VEGF表達減少血管生成作用；②體內(nèi)外生長的PLA-