雷帕霉素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞體外增殖、凋亡及趨化因子受體CXCR4表達(dá)的影響.pdf

1、目的：Rapamycin作為mTOR的抑制劑廣泛應(yīng)用移植物排斥反應(yīng)。近年來(lái)，有研究表明rapamycin體外有抑制骨髓瘤細(xì)胞系增殖作用，體內(nèi)應(yīng)用于荷骨髓瘤小鼠模型使瘤體縮小。Rapamycin對(duì)MM細(xì)胞作用的機(jī)制尚未完全闡明。本研究將mTOR抑制劑rapamycin應(yīng)用于人MM細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞，觀察rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖、凋亡的影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，cyclinD1在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著重要的作用，在MM細(xì)

2、胞呈高表達(dá)，與MM細(xì)胞的增殖相關(guān)，檢測(cè)rapamycin作用前后MM細(xì)胞cyclinD1的表達(dá)情況，可以了解rapamycin抑制MM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡是否與cyclinD1表達(dá)調(diào)控有關(guān).CXCR4作為趨化因子受體在MM細(xì)胞歸巢中起著重要的作用，通過(guò)CXCR4/SDF-1使MM細(xì)胞定位于骨髓。有研究表明CXCR4陽(yáng)性的造血細(xì)胞可以使AKI、磷酸化，同時(shí)誘導(dǎo)分泌VEGF，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究通過(guò)檢測(cè)rapamycin作用后CXCR

3、4在RPMI8226細(xì)胞中mRNA以及蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討rapamycin對(duì)骨髓瘤細(xì)胞作用的分子生物學(xué)機(jī)制，為本藥臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 人類(lèi)MM細(xì)胞株RPMI8226的培養(yǎng)和傳代人MM細(xì)胞株RPMI8226，培養(yǎng)于含20％滅活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100 μ g/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-

4、6天傳代1次，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 2.Rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響 2.1 MTT法檢測(cè)rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，加入不同濃度的rapamycin分別作用24h、48h、72h，培養(yǎng)結(jié)束前4h加入20 μl MTT(5mg/ml)；離心培養(yǎng)板，小心吸去上清，加入DMSO 200 μl，振蕩溶解f

5、ormazon結(jié)晶，酶標(biāo)儀490nm測(cè)A值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2.2 Rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)期周期阻滯的影響應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的rapamycin，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，4℃低速離心，PBS洗滌2遍。加入-20℃預(yù)冷的80％乙醇2ml混勻，4"C過(guò)夜。用PBS洗滌2次，10g/L的PI染液染色30min，上FACSCallibur流式儀檢測(cè)，CellQuest軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析

6、，計(jì)算各期細(xì)胞所占的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。 2.3 Rapamycin對(duì)RPMI8226凋亡的影響采用倒置顯微鏡下原位形態(tài)學(xué)觀察及FCM檢測(cè)Sub-G1期細(xì)胞比例方法。 3.Rapamycin對(duì)人MM細(xì)胞株RPMI8226趨化因子受體CXCR4、cyclinD和mTOR表達(dá)的影響 3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4表達(dá)率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整

7、細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，加入不同濃度rapamycin作用24h后，收集細(xì)胞，用冷PBS洗兩遍后，各取細(xì)胞懸液100μl，分別加入CD184(CXCR4單抗)6μl，對(duì)照組加入CD46μl，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30分鐘，立即在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，計(jì)數(shù)104細(xì)胞，以對(duì)照管作為陰性對(duì)照，CELLQuest軟件分析，粘附分子CD184表達(dá)水平以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。 3.2 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(semiq

8、uantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測(cè)rapamycin不同濃度不同時(shí)間作用于RPMI8226細(xì)胞后CXCR4和cyclinD1 mRNA的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，CXCR4及cyclinD1 mRNA/β-actin mRNA作為CXCR4及cyclinD1的相對(duì)表達(dá)豐度。 3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)

9、方法檢測(cè)rapamycin不同濃度作用于RPMI8226細(xì)胞后mTOR mRNA水平的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，通過(guò)公式X0=2[Ct(β-actin)-Ct(mTOR)]，計(jì)算mTOR mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果： 1.Rapamycin體外可影響人MM細(xì)胞株RPMI8226的增殖、凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)程 1.1 Rapamycin對(duì)細(xì)胞增殖的影響：Rapamycin抑制RPMI8226細(xì)胞增殖，并且呈現(xiàn)時(shí)間及

10、劑量依賴(lài)性。72h的rapamycin的IC50值為20nmol/L。當(dāng)rapamycin濃度為1nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L、500 mnol/L時(shí)，24h的細(xì)胞增殖抑制率分別為5％、6％、11％、14％、16％、20％、29％；48h的細(xì)胞增殖抑制率分別為27％、32％、42％、46％、51％、58％、62％；72h的細(xì)胞增殖抑制率分別為32％、35％

11、、45％、52％、58％、64％、71％。 1.2 Rapamycin作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：相差顯微鏡觀察20nmol/L的rapamycin作用24h、48h、72h后，RPMI8226細(xì)胞出現(xiàn)折光性減低，體積縮小，胞漿顆粒及空泡，胞核固縮及核碎裂，并且可見(jiàn)細(xì)胞碎片。對(duì)照組(不加rapamycin組)細(xì)胞則形態(tài)完整，核物質(zhì)分布均勻，細(xì)胞無(wú)凋亡形態(tài)學(xué)改變。 1.3 Rapamycin對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響：Rapamyci

12、n濃度為0nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L時(shí)，作用于RPMI8226 48h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用藥前后細(xì)胞周期阻滯情況。結(jié)果顯示：不同濃度的G0/G1期的細(xì)胞比例分別為：40.11％、51.24％、52.36％、60.01％、71.96％、73.25％，且亞G1(sub-G1)期細(xì)胞增加，提示隨rapamycin濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例呈上升趨

13、勢(shì)，出現(xiàn)G0/G1期阻滯及細(xì)胞凋亡。 2.Rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞趨化因子受體CXCR4表達(dá)的影響：Rapamycin作用于RPMI8226細(xì)胞24h、48h、72h后，隨著rapamycin濃度增加，RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示趨化因子受體CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化。 3.Rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞周期蛋白D1mRNA表達(dá)的影響：不同濃度ra

14、pamycin作用RPMI8226細(xì)胞24h后，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)顯示隨rapamycin濃度增加cyclin D1 mRNA表達(dá)水平下降。 4 Rapamycin對(duì)RPMI8226細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)的影響：不同濃度rapamycin作用RPMI8226細(xì)胞24h后，應(yīng)用RQ-PCR檢測(cè)顯示隨rapamycin濃度增加mTOR mRNA表達(dá)水平下降。 結(jié)論： 1.在一定濃度范圍內(nèi)，rapamycin以時(shí)