雷帕霉素對骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞體外增殖、凋亡及趨化因子受體CXCR4表達的影響.pdf

1、目的：Rapamycin作為mTOR的抑制劑廣泛應用移植物排斥反應。近年來，有研究表明rapamycin體外有抑制骨髓瘤細胞系增殖作用，體內(nèi)應用于荷骨髓瘤小鼠模型使瘤體縮小。Rapamycin對MM細胞作用的機制尚未完全闡明。本研究將mTOR抑制劑rapamycin應用于人MM細胞系RPMI8226細胞，觀察rapamycin對RPMI8226細胞增殖、凋亡的影響。有學者研究發(fā)現(xiàn)，cyclinD1在細胞增殖過程中起著重要的作用，在MM細

2、胞呈高表達，與MM細胞的增殖相關，檢測rapamycin作用前后MM細胞cyclinD1的表達情況，可以了解rapamycin抑制MM細胞增殖并誘導其凋亡是否與cyclinD1表達調(diào)控有關.CXCR4作為趨化因子受體在MM細胞歸巢中起著重要的作用，通過CXCR4/SDF-1使MM細胞定位于骨髓。有研究表明CXCR4陽性的造血細胞可以使AKI、磷酸化，同時誘導分泌VEGF，進而促進腫瘤的發(fā)生。本研究通過檢測rapamycin作用后CXCR

3、4在RPMI8226細胞中mRNA以及蛋白水平的表達變化，進一步探討rapamycin對骨髓瘤細胞作用的分子生物學機制，為本藥臨床應用奠定理論基礎。 方法： 1.細胞培養(yǎng)和傳代 人類MM細胞株RPMI8226的培養(yǎng)和傳代人MM細胞株RPMI8226，培養(yǎng)于含20％滅活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100 μ g/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5-

4、6天傳代1次，實驗用對數(shù)生長期的細胞。 2.Rapamycin對RPMI8226細胞生長抑制的影響 2.1 MTT法檢測rapamycin對RPMI8226細胞生長抑制的影響取對數(shù)生長期的RPMI8226細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，加入不同濃度的rapamycin分別作用24h、48h、72h，培養(yǎng)結束前4h加入20 μl MTT(5mg/ml)；離心培養(yǎng)板，小心吸去上清，加入DMSO 200 μl，振蕩溶解f

5、ormazon結晶，酶標儀490nm測A值，繪制細胞生長曲線。 2.2 Rapamycin對RPMI8226細期周期阻滯的影響應用流式細胞術檢測。在細胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的rapamycin，培養(yǎng)48h后，收集細胞，4℃低速離心，PBS洗滌2遍。加入-20℃預冷的80％乙醇2ml混勻，4"C過夜。用PBS洗滌2次，10g/L的PI染液染色30min，上FACSCallibur流式儀檢測，CellQuest軟件進行細胞周期分析

6、，計算各期細胞所占的比例。實驗重復3遍。 2.3 Rapamycin對RPMI8226凋亡的影響采用倒置顯微鏡下原位形態(tài)學觀察及FCM檢測Sub-G1期細胞比例方法。 3.Rapamycin對人MM細胞株RPMI8226趨化因子受體CXCR4、cyclinD和mTOR表達的影響 3.1流式細胞術檢測rapamycin對RPMI8226細胞表面趨化因子受體CXCR4表達率的影響取對數(shù)生長的RPMI8226細胞，調(diào)整

7、細胞密度為2×105/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，加入不同濃度rapamycin作用24h后，收集細胞，用冷PBS洗兩遍后，各取細胞懸液100μl，分別加入CD184(CXCR4單抗)6μl，對照組加入CD46μl，輕輕混勻，室溫避光反應30分鐘，立即在流式細胞儀上檢測，計數(shù)104細胞，以對照管作為陰性對照，CELLQuest軟件分析，粘附分子CD184表達水平以陽性細胞百分數(shù)表示。 3.2 半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(semiq

8、uantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測rapamycin不同濃度不同時間作用于RPMI8226細胞后CXCR4和cyclinD1 mRNA的表達，以β-actin為內(nèi)對照，CXCR4及cyclinD1 mRNA/β-actin mRNA作為CXCR4及cyclinD1的相對表達豐度。 3.3 實時熒光定量PCR(RQ-PCR)

9、方法檢測rapamycin不同濃度作用于RPMI8226細胞后mTOR mRNA水平的表達，以β-actin為內(nèi)對照，通過公式X0=2[Ct(β-actin)-Ct(mTOR)]，計算mTOR mRNA的表達量。 結果： 1.Rapamycin體外可影響人MM細胞株RPMI8226的增殖、凋亡及細胞周期進程 1.1 Rapamycin對細胞增殖的影響：Rapamycin抑制RPMI8226細胞增殖，并且呈現(xiàn)時間及

10、劑量依賴性。72h的rapamycin的IC50值為20nmol/L。當rapamycin濃度為1nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L、500 mnol/L時，24h的細胞增殖抑制率分別為5％、6％、11％、14％、16％、20％、29％；48h的細胞增殖抑制率分別為27％、32％、42％、46％、51％、58％、62％；72h的細胞增殖抑制率分別為32％、35％

11、、45％、52％、58％、64％、71％。 1.2 Rapamycin作用后細胞形態(tài)學變化：相差顯微鏡觀察20nmol/L的rapamycin作用24h、48h、72h后，RPMI8226細胞出現(xiàn)折光性減低，體積縮小，胞漿顆粒及空泡，胞核固縮及核碎裂，并且可見細胞碎片。對照組(不加rapamycin組)細胞則形態(tài)完整，核物質分布均勻，細胞無凋亡形態(tài)學改變。 1.3 Rapamycin對細胞周期進程的影響：Rapamyci

12、n濃度為0nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L時，作用于RPMI8226 48h后，應用流式細胞術檢測用藥前后細胞周期阻滯情況。結果顯示：不同濃度的G0/G1期的細胞比例分別為：40.11％、51.24％、52.36％、60.01％、71.96％、73.25％，且亞G1(sub-G1)期細胞增加，提示隨rapamycin濃度增加，G0/G1期細胞比例呈上升趨

13、勢，出現(xiàn)G0/G1期阻滯及細胞凋亡。 2.Rapamycin對RPMI8226細胞趨化因子受體CXCR4表達的影響：Rapamycin作用于RPMI8226細胞24h、48h、72h后，隨著rapamycin濃度增加，RT-PCR和流式細胞術檢測顯示趨化因子受體CXCR4 mRNA和蛋白表達水平呈現(xiàn)出下降趨勢，隨時間延長無明顯變化。 3.Rapamycin對RPMI8226細胞周期蛋白D1mRNA表達的影響：不同濃度ra

14、pamycin作用RPMI8226細胞24h后，應用RT-PCR檢測顯示隨rapamycin濃度增加cyclin D1 mRNA表達水平下降。 4 Rapamycin對RPMI8226細胞mTOR mRNA表達的影響：不同濃度rapamycin作用RPMI8226細胞24h后，應用RQ-PCR檢測顯示隨rapamycin濃度增加mTOR mRNA表達水平下降。 結論： 1.在一定濃度范圍內(nèi)，rapamycin以時