膀胱腫瘤RASSF1A基因家族啟動(dòng)子高甲基化狀況研究.pdf

1、甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。該機(jī)制的異化可導(dǎo)致基因表達(dá)的異常及基因組穩(wěn)定性的降低，繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。啟動(dòng)子CpG島的高甲基化已被認(rèn)為是與遺傳性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在腫瘤中失活的分子生物學(xué)機(jī)制。我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)使用甲基特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)膀胱腫瘤RASSF1A基因甲基化，雖然表明兩者存在一定關(guān)聯(lián)，但臨床診斷意義不高。 本研究擬從以下兩個(gè)方面探索提高膀胱腫

2、瘤標(biāo)本RASSFlA基因甲基化臨床診斷意義的途徑。 一，改變退火溫度對(duì)甲基特異性PCR檢驗(yàn)指標(biāo)有效性的影響。 目的：探討改變退火溫度對(duì)甲基特異性PCR檢驗(yàn)指標(biāo)有效性及診斷意義的影響。 方法：將經(jīng)測(cè)序證實(shí)的RASSF1A完全甲基化標(biāo)本作為100％M標(biāo)本，完全未甲基化標(biāo)本作為0％M標(biāo)本，按1:3體積比例混合，作梯度PCR擴(kuò)增，摸索適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟取＿x取單一電泳條帶的溫度為優(yōu)化的退火溫度，并以這些溫度檢測(cè)70例標(biāo)本(35

3、對(duì)，以同一病人的腫瘤組織K、癌旁組織N為一對(duì))，比較其在各溫度情況時(shí)的擴(kuò)增效果。 結(jié)果：70歲以下組60.7℃陰性似然比0、陰性預(yù)測(cè)值1.00、診斷靈敏度1.00、ROE曲線(xiàn)面積值0.750；而文獻(xiàn)使用溫度64.0℃陰性似然比0.8、陰性預(yù)測(cè)值0.56、診斷靈敏度0.33、ROC曲線(xiàn)面積值0.583：70歲以上組60.7℃陰性似然比0.67、陰性預(yù)測(cè)值0.60、ROC曲線(xiàn)面積值0.529。其余各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：

4、應(yīng)用MSP檢測(cè)RASSF1A甲基化可以作為膀胱腫瘤早期診斷的輔助方法，較低年齡組的應(yīng)用價(jià)值大于高年齡組，尤其是在排除腫瘤方面。臨床腫瘤標(biāo)本具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性，使用各種方法檢測(cè)臨床標(biāo)本要充分考慮到各種生物學(xué)因素(如：年齡等)的影響。在應(yīng)用MSP檢測(cè)臨床腫瘤標(biāo)本時(shí)，可根據(jù)不同年齡段調(diào)整退火溫度，以提高檢驗(yàn)指標(biāo)的有效性及診斷價(jià)值。 二，應(yīng)用McMSP分析RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。 目的：應(yīng)用McMSP分析RASSF1A啟動(dòng)

5、子區(qū)域甲基化狀況，探索McMSP定量檢測(cè)甲基化的可行性、靈敏度、診斷價(jià)值，并簡(jiǎn)化操作流程，降低成本。 方法：先對(duì)已行常規(guī)甲基特異性PCR(MSP)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析(Melting Curve Anlysis，MCA)；然后將熒光素SYBR Green Ⅰ直接加入PCR反應(yīng)前體系進(jìn)行擴(kuò)增(即McMSP)；探索McMSP分析的靈敏度：將標(biāo)本按1:10，1:100，1:500，1:1000，1:5000，1:10000稀釋

6、后，分別行MSP和McMSP。 結(jié)果：(1)沒(méi)有應(yīng)用商業(yè)試劑盒，同時(shí)將文獻(xiàn)報(bào)道的SYBR Green Ⅰ濃度降低至10000x，仍能獲得滿(mǎn)意的結(jié)果；(2)常規(guī)MSP標(biāo)本1:100稀釋(DNA量>100pg)時(shí)就已檢測(cè)不到目的產(chǎn)物，而該法在DNA 1:10000稀釋后(DNA量<2pg)，仍可以檢測(cè)到所需要的目的產(chǎn)物；(3)McMSPROC曲線(xiàn)分析，70歲以下組、70歲以上組及所有標(biāo)本Tm cut-off值分別為62.525、63

7、.535、62.935；ROC面積值分別為0.846、0.750、0.819。 結(jié)論：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線(xiàn)分析法檢測(cè)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域甲基化迅速準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，結(jié)果直觀，并具有較常規(guī)MSP更高的靈敏度和診斷價(jià)值。 三，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了膀胱腫瘤RASSF1A家族基因RASSF2A、NORE1A甲基化狀況及RASSF1A的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 目的：在已完成膀胱腫瘤RASSF1A基因甲基化檢測(cè)的基

8、礎(chǔ)上，對(duì)RASSF基因家族的甲基化狀況做初步篩查，并在蛋白質(zhì)層面探討RASSF1A DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系。 方法：采用MSP技術(shù)檢測(cè)54例膀胱癌組織及其相應(yīng)癌周正常組織RASSF2A、NORE1A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)18例膀胱正常組織及38例膀胱移行上皮癌(TCC)組織中RASSF1A基因的表達(dá)情況，并與臨床特征相比較。 結(jié)果：(1)RASSF2A檢出率僅為2/54，NORE1A僅為0/5

9、4；(2)相應(yīng)癌周正常組織和3例正常膀胱組織均未發(fā)現(xiàn)該基因高甲基化改變；(3)甲基化狀態(tài)與膀胱癌臨床病理參數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性； (4)RASSF1A在膀胱TCC和正常組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性率分別為39％和83％；將免疫組化結(jié)果判讀為(-)者與對(duì)應(yīng)DNA甲基化、mRNA表達(dá)兩個(gè)指標(biāo)對(duì)照，相應(yīng)標(biāo)本分別有83.3％(20/24)存在DNA甲基化，79.2％(19/24)存在mRNA表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：在膀胱癌中，RASSF2A、NORE1A