宮頸癌中DLEC1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、[目的]
　　研究肺癌食管癌缺失基因1(Deleted in lung and esophageal cancer1，DLEC1)啟動子甲基化對宮頸癌發(fā)病的影響，及DLEC1基因甲基化與高危型人乳頭瘤病毒(High risk Human papilloma virus，hrHPV)感染之間的關(guān)系，研究去甲基化藥物對宮頸癌細(xì)胞增殖以及對DLEC1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)、該基因mRNA表達(dá)的影響，初步探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌早期

2、診斷與治療提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1.收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2010年6月至2014年8月的宮頸活檢或手術(shù)切除標(biāo)本60例，已經(jīng)石蠟包埋。宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cercical intraepithelialneoplasia，CIN)-Ⅲ與宮頸癌設(shè)為病例組，共40例，宮頸炎與CIN-Ⅰ及CIN-Ⅱ設(shè)為對照組，共20例;培養(yǎng)3種宮頸癌細(xì)胞系:HeLa、C33A、Caski。采用甲基化特異性PCR(Methylatio

3、n-specific PCR，MSP)方法，檢測DLEC1基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。
　　2.采用普式引物GP5+/GP6+，經(jīng)PCR及直接測序檢測宮頸石蠟標(biāo)本中HPV的感染情況。
　　3.分析宮頸石蠟標(biāo)本中DLEC1基因甲基化與hrHPV感染之間的相關(guān)性。
　　4.MTT比色法檢測不同濃度的去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC）干預(yù)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖情

4、況。
　　5.應(yīng)用5-aza-dC誘導(dǎo)HeLa、C33A、Caski3種宮頸癌細(xì)胞系去甲基化后，MSP檢測甲基化逆轉(zhuǎn)情況，實時定量PCR法檢測DLEC1基因mRNA的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　1.宮頸石蠟標(biāo)本中DLEC1基因的甲基化狀態(tài)
　　病例組中，DLEC1基因甲基化率為54.5％(18/33)，明顯高于對照組14.3％(2/14)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。年齡大于46歲的患者DLEC1基因甲基化率

5、為60.9％(14/23)高于年齡小于46歲的患者(40.0％，4/10)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.宮頸石蠟標(biāo)本中HPV感染情況
　　(1)宮頸石蠟標(biāo)本中，HPV陽性檢出率為80.0％(48/60)，其中病例組中HPV陽性檢出率為90.0％(36/40)，對照組中HPV陽性檢出率為60.0％(12/20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)在宮頸石蠟標(biāo)本中，PCR檢測出8種亞型的

6、HPV，以高危型HPV為主，其在病例組和對照組的陽性檢出率分別為87.5％(35/40)和50.0％(10/20)，兩者比較有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.宮頸石蠟標(biāo)本中DLEC1基因甲基化與hrHPV感染之間的相關(guān)性
　　在病例組中hrHPV陽性患者DLEC1基因的甲基化率為57.1％(16/28)，hrHPV陰性患者DLEC1基因的甲基化率為40％(2/5)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);在對照組，hr

7、HPV陽性患者DLEC1基因的甲基化率為33.3％(2/6)，hrHPV陰性患者DLEC1的甲基化率為0(0/2)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.5-aza-dC處理對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響
　　與對照組相比，C33A細(xì)胞在10μmol/L5-aza-dC作用48 h后，開始出現(xiàn)明顯的生長抑制（P＜0.05）。隨藥物濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，20μmol/L藥物濃度處理72 h對C33A細(xì)胞的抑制作用

8、最強(qiáng)，細(xì)胞存活率為78.3％; HeLa細(xì)胞在5μmol/L藥物濃度作用72 h后，開始出現(xiàn)生長抑制（P＜0.05），在20μmol/L藥物濃度作用72 h后，細(xì)胞存活率最低(86.1％);Caski細(xì)胞在20μmol/L藥物濃度作用48 h后開始出現(xiàn)生長抑制（P＜0.05），在20μmol/L藥物濃度作用72 h后，細(xì)胞存活率最低(87.2％)。
　　5.5-aza-dC處理對宮頸癌細(xì)胞DLEC1基因甲基化狀態(tài)及該基因mRNA表

9、達(dá)的影響
　　(1)5-aza-dC作用前，宮頸癌細(xì)胞C33A、HeLa、Caski中DLEC1基因啟動子區(qū)呈甲基化狀態(tài)。
　　(2)經(jīng)5-aza-dC處理后，宮頸癌C33A細(xì)胞中DLEC1基因啟動子區(qū)出現(xiàn)非甲基化條帶，甲基化條帶消失，與對照組相比，DLEC1基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)2.33倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，HeLa細(xì)胞和Caski細(xì)胞中DLEC1基因甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)量均未見明顯改變。
　　

10、[結(jié)論]
　　1.病例組中DLEC1基因的甲基化率明顯高于對照組，提示DLEC1基因甲基化可能與宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，可以作為宮頸癌早期診斷的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。
　　2.DLEC1基因甲基化與hrHPV感染無關(guān)，提示DLEC1基因啟動子甲基化在宮頸癌的發(fā)病中是不依賴于HPV感染的一個獨立事件。
　　3.去甲基化藥物處理后，宮頸癌細(xì)胞的存活率明顯降低，提示該藥物可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖活性，可作為研究宮頸癌靶向治療的藥物。<