一氧化氮對小鼠成骨細胞的生長和礦化調控.pdf

1、牙槽骨、頜骨骨質喪失是全身或局部因素長期作用于口腔頜面部的表現(xiàn)，對臨床種植牙成功率有重要影響。全身代謝狀況和局部骨組織病理性改變可能導致成骨細胞功能受損，破壞骨細胞、成骨細胞和破骨細胞之間的聯(lián)系，不利于種植體達到完善的骨整合以及遠期穩(wěn)定性。如果能夠通過藥物和種植體設計調控骨的改建和重建行為，口頜骨缺失患者的牙種植修復會得到進一步廣泛應用。 由于全身骨量減少和頜骨骨喪失的相關性，國外學者應用影響全身骨礦密度的治療方法如激素替代療法

2、、二膦酸鹽等，對牙槽骨、頜骨丟失也產(chǎn)生了一定效果。不過，目前臨床上還沒有治療全身或局部骨丟失的理想藥物或方法。 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是半衰期極短的一種自由基氣體分子，來源于L-精氨酸，由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化。近年來人們對NO在骨代謝以及骨細胞活性方面的影響做了大量研究，發(fā)現(xiàn)NO是骨形成和骨吸收過程中極為重要的調節(jié)因子，但關于NO在頜骨骨代謝方面作用的研究還很

3、少。 本實驗作為人工種植牙給藥系統(tǒng)實驗研究的一部分，通過比較NO供體S亞硝基N乙酰基青霉胺(S-nitroso-N-acetyl-dl-penicillamine，SNAP)、L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)以及NOS抑制劑NG-亞硝基L精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME)對小鼠原代分離培養(yǎng)的牙槽骨成骨細胞和成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1的增殖、分化及礦化

4、的作用，以及對藥物導致的快速骨質喪失小鼠模型頜骨骨礦化的影響，探討NO在頜骨成骨細胞生長分化中可能的途徑和機制，為進一步研究頜骨骨代謝提供實驗基礎，為臨床人工種植牙全身或局部給藥提高骨質缺失頜骨之牙種植成功率提供實驗依據(jù)。 本研究共分三個部分： 第一部分： 目的：分離培養(yǎng)和鑒定小鼠牙槽骨來源的成骨細胞。方法：采用酶消化法和植塊法相結合，分離培養(yǎng)并觀察成骨細胞形態(tài)，測定原代成骨細胞生長曲線和細胞分裂曲線。用堿性磷酸

5、酶染色和Von Kossa實驗檢測成骨細胞礦化的表現(xiàn)型。結果：酶消化法和植塊法相結合可增加細胞成活率，提高培養(yǎng)效率，獲得了較高純度和數(shù)量的成骨細胞。成骨細胞堿性磷酸酶染色可見成骨細胞胞漿陽性紅色無定形沉淀，Von Kossa染色見細胞聚集處有棕黑色顆粒附著。骨鈣素免疫組織化學染色胞漿呈棕黃色陽性著色。培養(yǎng)21天茜素紅染色可見紅色礦化結節(jié)。結論：優(yōu)化的原代成骨細胞培養(yǎng)方法，可為研究小鼠牙槽骨代謝中細胞生長分化的調控機制提供合適的實驗對象。

6、 第二部分： 目的：探討一氧化氮對小鼠原代牙槽骨成骨細胞以及成骨細胞前體細胞MC3T3-E1的礦化調控作用。方法：分別給于原代成骨細胞、成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1 NO外源性供體SNAP3周，檢測成骨細胞DNA含量和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性。Von Kossa方法檢測細胞合成鈣情況，RT-PCR檢測核轉錄因子結合因子Cbfa1基因表達變化，Western Blot檢測骨唾

7、液酸蛋白(Bone Sialoprotein，BSP)表達變化。結果：和未加藥物對照組及礦化液作用組相比，SNAP可明顯增加成骨細胞DNA含量和堿性磷酸酶活性，培養(yǎng)2周后，細胞內(nèi)大量鈣鹽開始沉積。Cbfa1基因在藥物作用的第3天表達上調到達高峰，到第7天表達逐漸下降，而培養(yǎng)14天可檢測到骨唾液酸蛋白表達明顯上調。SNAP單獨應用無明顯礦化作用。結論：一定濃度一氧化氮可加速小鼠原代培養(yǎng)的牙槽骨成骨細胞以及成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1

8、增殖分化，并可能通過調控Cbfa1基因和骨唾液酸蛋白表達促進成骨細胞分化成熟，刺激骨的礦化。 第三部分： 目的：探討一氧化氮對頜骨骨代謝的作用。方法：應用藥物維A酸制作小鼠骨質快速喪失模型。比較NO供體L-Arg，NOS抑制劑L-NAME對小鼠全身骨密度，股骨骨密度以及頜骨骨密度的變化，血清學檢測鈣、磷、堿性磷酸酶和骨鈣素的表達變化，免疫組織化學檢測骨唾液酸蛋白表達。結果：L-NAME可加重模型組小鼠骨質喪失，L-精氨酸