大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞移植治療心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的： 心肌梗死是造成中老年人死亡的主要原因之一。目前常規(guī)的治療措施如藥物治療、介入治療等，雖有很好的臨床效果，但都不能逆轉(zhuǎn)死亡的心肌細(xì)胞。細(xì)胞移植治療能夠取代壞死的心肌細(xì)胞、增加有收縮功能的細(xì)胞數(shù)量，從而達到改善心功能的目的，被認(rèn)為是具有廣泛臨床應(yīng)用前景的一種理想治療手段。目前許多實驗都表明骨骼肌成肌細(xì)胞是作為細(xì)胞移植較為理想的一種供體細(xì)胞，但大多數(shù)實驗都使用原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞，本實驗應(yīng)用L6骨骼肌成肌細(xì)胞株移植，探討骨骼肌成

2、肌細(xì)胞株移植治療心肌梗死的可行性及不同數(shù)量的移植細(xì)胞對心肌梗死大鼠心功能改善的影響，以為今后的研究提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。 方法 1 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)及標(biāo)記大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后在37℃，5％CO<,2>條件下培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、抗生素)，細(xì)胞生長達80％～90％融合時傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用含2倍DMEM培養(yǎng)基的膠體金溶液標(biāo)記20～24小時后，收集細(xì)胞、分裝，移植備用。HE染色觀察細(xì)

3、胞形態(tài)，透射電鏡檢查細(xì)胞的標(biāo)記率。 2 大鼠心肌梗死模型的制備及心梗后不同時間心肌組織病理學(xué)變化的觀察選健康雄性SD大鼠60只，采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制作大鼠心肌梗死模型。分別于造模后1天、1周、2周、3周、4周取材，用HE染色、免疫組化的方法觀察心肌的組織病理學(xué)變化，并用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞細(xì)胞周期的變化。 3 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)的生長發(fā)育情況95只健康雄性SD大鼠隨機分為5組：

4、對照組、1×10<'6>移植組、2×10<'6>移植組、4×10<'6>移植組和1×10<'7>移植組。其中對照組15只，其余每組各20只。采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制作心梗模型，造模后立即注射相應(yīng)數(shù)量的L6骨骼肌成肌細(xì)胞至各實驗組大鼠心梗區(qū)，對照組注射等量的無血清培養(yǎng)基。移植后1周、2周、3周、4周取材，用HE染色、免疫組化、透射電鏡和流式細(xì)胞儀檢測的方法觀測移植的細(xì)胞在大鼠心梗區(qū)內(nèi)的生長發(fā)育情況。移植后4周通過血流動力學(xué)的各項指

5、標(biāo)評價各組大鼠心功能的變化情況。 結(jié)果 1 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和標(biāo)記大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)1天后大部分細(xì)胞貼壁并生長，細(xì)胞多數(shù)為紡錘形，有一到兩個橢圓形細(xì)胞核，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞增殖旺盛，2天后可達到80％～90％融合。膠體金標(biāo)記后透射電鏡觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)含膠體金顆粒的吞飲泡，標(biāo)記率達80％以上。 2 大鼠心肌組織在心梗后不同時間的組織病理學(xué)變化心肌梗死后1天，心肌壞死反應(yīng)顯著，以凝固性壞死

6、為主，1周左右心梗區(qū)炎癥反應(yīng)強烈，隨后梗死的心肌組織開始被膠原組織替代，瘢痕區(qū)逐漸擴大，于心梗后4周可形成透壁性心梗，室壁變薄、心室呈球形改變。PCNA免疫組化和流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果均顯示心梗后早期心梗區(qū)周圍的正常心肌細(xì)胞可以增殖，但是這種能力極為有限，并隨時間延長而減弱。 3 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)的生長發(fā)育狀況我們分別用免疫組化、透射電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀等手段檢測了L6骨骼肌成肌細(xì)胞在心肌梗死大鼠體內(nèi)的生

7、長情況。免疫組化結(jié)果顯示移植后早期PCNA陽性細(xì)胞較多，隨時間延長陽性細(xì)胞逐漸減少，desmin陽性細(xì)胞在移植后2周較多見，Cx43以及轉(zhuǎn)錄因子GATA-4在移植后各階段均未見表達。上述結(jié)果提示L6骨骼肌成肌細(xì)胞可以在大鼠心梗區(qū)存活并有較強的增殖能力，部分移植細(xì)胞可分化成肌管，但是移植細(xì)胞未與宿主的心肌細(xì)胞形成通訊連接且未向心肌細(xì)胞分化。移植后4周心功能測定結(jié)果顯示2×10<'6>移植組大鼠的LVSP、LNEDP、LVdp/dt和IN-

8、dp/dt相對于對照組及1×10<'6>移植組的上述指標(biāo)均有顯著差異，1×10<'6>移植組和對照組的上述指標(biāo)相比無顯著差異。這一結(jié)果提示移植細(xì)胞的數(shù)量越多對心功能的改善作用越明顯，但是也不是無限制的越多越好。我們的實驗發(fā)現(xiàn)4×10<'6>和1×10<'7>移植組的大鼠移植部位及其附近出現(xiàn)瘤樣增生，取材后檢測光鏡下移植細(xì)胞呈旺盛增生表現(xiàn)，核染色深、核分裂相多見，但未見異常核分裂相。細(xì)胞排列密集，呈團狀或束狀分布，并向周圍組織浸潤生長。透

9、射電鏡觀察移植細(xì)胞內(nèi)未見膠體金顆粒，胞質(zhì)內(nèi)未見肌絲樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核較大，核漿比大于1：3，某些細(xì)胞核異型性明顯。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA指數(shù)DI=1.31±0.14，與正常對照組(DI=1.00±0.11)相比有顯著差異，提示過量的移植細(xì)胞有致瘤傾向。 結(jié)論 1 用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法建立的大鼠心肌梗死動物模型，心梗后心肌組織病理學(xué)變化與臨床表現(xiàn)相近，且造模成功率高，是研究心肌修復(fù)的良好模型。 2 心肌梗

10、死后殘存的正常心肌細(xì)胞有一定的增殖能力。 3 本實驗采用膠體金標(biāo)記大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞，雖然體外標(biāo)記率較理想，但移植后光鏡和電鏡下不易識別，仍需探索更適宜的移植細(xì)胞標(biāo)記方法。 4 大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞移植入大鼠心梗區(qū)后可以存活、分化，其增殖能力較強，分化能力較弱。 5 2×10<'6>的大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞比1×10<'6>有更好的改善心功能的效果。 6 過量的大鼠L6骨骼肌成肌細(xì)胞可以在宿