Th17-Treg細胞免疫調(diào)節(jié)平衡的變化在移植骨骼肌成肌細胞治療急性心肌梗塞中的研究.pdf

1、骨骼肌成肌細胞移植治療心肌梗死是最有潛力的治療措施，目前多項研究顯示移植進入心梗區(qū)域的同種異體骨骼肌成肌細胞的存活率非常低，一般24小時后的存活率低于20％，這已經(jīng)是不爭的事實，嚴重的影響了骨骼肌成肌細胞的治療效果。可能與同種異體骨骼肌成肌細胞移植進入心肌梗死區(qū)誘發(fā)的炎癥和免疫反應相關。Th17/Treg細胞之間的免疫調(diào)節(jié)平衡可能在炎癥和免疫反應過程中起到重要作用，因此，我們的研究明確了在骨骼肌成肌細胞移植過程中誘發(fā)了Th17/Treg

2、細胞之間的不平衡。
　　VEGF不僅是血管形成的主要調(diào)節(jié)因子，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應中起到中要的作用。新型的納米顆粒-高分支聚乙二胺(hPAMAM)作為一種非病毒的、低毒性的、高效的載體，產(chǎn)生炎癥反應的作用很小，可以保護攜帶的基因免于蛋白酶的消化分解。因此，我們選擇利用hPAMAM作為載體攜帶VEGF165基因轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細胞，然后移植進入心梗區(qū)域，VEGF165可以在心梗區(qū)域緩慢的釋放，達到長效的作用，有利于微血管的生成和生長，有

3、利于炎癥的緩解，從而緩解了Th17/Treg細胞之間免疫調(diào)節(jié)的不平衡。
　　第一部分骨骼肌成肌細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定，以及VEGF165基因的轉(zhuǎn)染
　　目的:分離C57BL/6小鼠的骨骼肌成肌細胞，并在體外進行培養(yǎng)、純化和鑒定。將cDNA-VEGF165與表達載體納米顆粒超支化聚乙二胺(hPAMAM)結(jié)合后，轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細胞，檢測最佳轉(zhuǎn)染效率。
　　方法:注射0.1ml布比卡因預處理激3-4周小鼠體內(nèi)骨骼肌成肌細胞，

4、48h后采用混合酶（Ⅱ型膠原酶+dispease）一步消化法和Percoll非連續(xù)密度梯度法提取骨骼肌成肌細胞，然后采用反復差速貼壁法純化骨骼肌成肌細胞。使用特異抗原desmin和α-sarcomeric actin鑒定骨骼肌成肌細胞。分別將0.4ug、0.6ug、0.8ug的cDNA-VEGF165按照1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例與hPAMAM結(jié)合，然后分別與2×104的骨骼肌成肌細胞共培養(yǎng)4h，使用活細胞實時監(jiān)視

5、儀Cell-IQ細胞培養(yǎng)平臺觀察轉(zhuǎn)染hPAMAM-VEGF165表達載體的骨骼肌成肌細胞的生長情況和細胞數(shù)量變化，使用自由分布圖像軟件分析監(jiān)測的數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:骨骼肌成肌細胞呈現(xiàn)貼壁生長，分離后3天左右貼壁，7-9天左右可見逐漸融合生長，細胞呈長梭形、紡錘形，可呈線狀生長，融合后可以形成肌管樣結(jié)構。骨骼肌成肌細胞特異抗原desmin和α-sarcomeric actin呈陽性表達，流式細胞儀檢測顯示desmin陽性的細胞占82.

6、34+2.96％，α-sarcomeric actin陽性的細胞占80.1+3.39％，desmin和α-sarcomeric actin雙陽性的骨骼肌成肌細胞占81.22±3.23％。hPAMAM-VEGF表達載體轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件是:VEGF165質(zhì)粒的數(shù)量為0.4ug，V∶N為1∶8時，骨骼肌成肌細胞的增殖最接近正常細胞的生長，而且分泌的VEGF達到最大值。
　　結(jié)論:采用混合酶一步消化法、Percoll非連續(xù)

7、密度梯度法和反復差速貼壁法可以得到數(shù)量較多和純度較高的骨骼肌成肌細胞。hPAMAM表達載體可以攜帶VEGF165轉(zhuǎn)染骨骼肌成肌細胞，可以作為一種新型的低毒性的非病毒載體。
　　第二部分急性心肌梗塞動物模型的建立和移植骨骼肌成肌細胞治療急性心肌梗塞
　　目的:正確建立急性心肌梗塞模型，觀察骨骼肌成肌細胞移植治療急性心肌梗塞的可行性和有效性。
　　方法:使用氣體麻醉，左側(cè)開胸的方式，直視下結(jié)扎前降支近端，形成急性前壁心肌梗

8、塞，然后使用微量注射器分不同位點將骨骼肌成肌細胞注射進入心肌梗塞周圍區(qū)域，分為急性心梗組（AMI組）、單純骨骼肌成肌細胞移植組（AMI-S組）和轉(zhuǎn)染hPAMAM-VEGF165的骨骼肌成肌細胞移植組（AMI-V組）。分別在術前、術后1d、術后1w和術后4w觀察小鼠體重的變化。分別在術前、術后即刻、術后1w、術后4w使用心超測量小鼠心功能，觀察EF的變化。然后在活體經(jīng)腎靜脈直接注射伊文氏藍觀察心肌梗塞的面積大小，取出心臟，使用TTC法觀察

9、心肌梗塞的深度和范圍。心臟組織免疫組化染色觀察心梗周圍CD4+T淋巴細胞浸潤的情況。
　　結(jié)果:制作小鼠心肌梗塞模型的成功率約為86％。在術前，AMI組、AMI-S組和AMI-V組三組小鼠體重之間無明顯差異。在術后1d，三組小鼠體重之間也未見明顯差異。然而，在術后1w，與AMI組小鼠體重（16.58±0.35克）相比，AMI-S組小鼠體重（17.66±0.30克）和AMI-V組小鼠的體重（18.34±0.28克）均明顯增加(P＜0

10、.05)，而且，與AMI-S組小鼠體重（17.66±0.30克）相比，AMI-V組小鼠的體重（18.34±0.28克）顯著增加(P＜0.05)。在術后4w，與AMI組小鼠體重（16.50±0.35克）相比，AMI-S組小鼠體重（18.23±0.34克）和AMI-V組小鼠的體重（18.97±0.18克）均明顯增加(P＜0.01)，而且，與AMI-S組相比，AMI-V組小鼠的體重顯著增加(P＜0.05)。直視下可以清楚的看到心肌梗塞的位置和

11、范圍，梗死范圍為左室前壁和心尖部，TTC實驗顯示心肌梗死貫穿全層。在術前，三組正常小鼠的左室EF未見明顯差異(P＞0.05)。在術后即刻，三組小鼠的左室EF也未見明顯差異(P＞0.05)。然而，在術后1w，與AMI組（31.54±3.23％）相比，AMI-S組(37.94±2.29％)和AMI-V組（46.28±2.44％）左室EF明顯升高(P＜0.05)，而且，與AMI-S組相比，AMI-V組左室EF明顯升高(P＜0.05)。在術后4

12、w，與AMI組（33.67±3.18％）相比，AMI-S組（56.28±2.83％）和AMI-V組(63.73±3.33％)左室EF明顯升高(P＜0.05)，而且，與AMI-S組相比，AMI-V組左室EF明顯升高(P＜0.05)。免疫組化染色可見心梗周圍CD4+淋巴細胞浸潤，在AMI-S組較為明顯。
　　結(jié)論:直視下冠脈結(jié)扎法可以有效地控制心肌梗塞的范圍，小鼠的心肌梗塞位置和范圍合適，符合實驗的要求。移植骨骼肌成肌細胞和轉(zhuǎn)染hPA

13、MAM-VEGF的骨骼肌成肌細胞治療急性心肌梗塞能有效地恢復心功能。
　　第三部分Th17/Treg細胞免疫調(diào)節(jié)平衡的變化
　　目的:探討移植骨骼肌成肌細胞治療心肌梗塞引起的Th17/Treg不平衡，探討移植轉(zhuǎn)染hPAMAM-VEGF165的骨骼肌成肌細胞治療急性心肌梗塞時，Th17/Treg不平衡是否被緩解。
　　方法:術后1d、2d、4d、7d，分別使用流式細胞儀檢測脾臟內(nèi)Treg細胞和Th17細胞的百分率，使用r

14、eal-time PCR分析脾臟和心臟組織中Treg細胞相關轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA水平，使用Bio-plex懸浮芯片分析血清中Treg細胞相關的調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10和Th17細胞相關促炎癥細胞因子IL-Iβ、IL-6、IL-17A，以及血清中VEGF的濃度。
　　結(jié)果:在AMI組、AMI-S組、AMI-V組中，CD4+CD25+Foxp3+ Treg的百分率、轉(zhuǎn)錄

15、因子Foxp3 mRNA水平、相關調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的濃度從手術后第一天開始呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，到第7天的時候達到最小值。與AMI組相比，AMI-S組Treg的百分率、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA水平、相關調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的濃度更低(P＜0.05或者P＜0.01)，而AMI-V組Treg的百分率、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA水平、相關調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10

16、的濃度更高（P＜0.05或者P＜0.01）。然而，CD4+IL-17+ Th17細胞的百分率、轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA水平、相關促炎癥細胞因子IL-1β、IL-6和IL-17A的濃度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，與AMI組相比，AMI-S組Th17的百分率、轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA水平、相關調(diào)節(jié)細胞因子TGF-β1、IL-2、IL-10的濃度明顯升高(P＜0.05或者P＜0.01)，而AMI-V組Th17的百分率、轉(zhuǎn)錄因子RORγt mR