腺病毒介導(dǎo)hBDNF基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療大鼠脊髓損傷.pdf

1、第一部分重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP的構(gòu)建與鑒定 目的:構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)志人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(hBDNF)基因腺病毒載體。 方法:以pDC316-hBDNF為模板，PCR擴(kuò)增酶切獲得hBDNF基因片段，并連接到帶有EGFP標(biāo)記基因的載體質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP上，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP，利用AdMax包裝系統(tǒng)，穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBHG

2、lox_E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP，反復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒后，離子交換法純化病毒，測(cè)定病毒顆粒數(shù)及滴度。 結(jié)果:經(jīng)PCR鑒定、限制性酶切分析及序列測(cè)定，證實(shí)成功構(gòu)建攜帶EGFP標(biāo)志hBDNF基因的重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP。擴(kuò)增純化后，測(cè)得重組腺病毒顆粒數(shù)為2.4×1011VP／

3、ml，OD260/OD280值約為2.0，滴度為0.8×1010CCID50/ml。 結(jié)論:已成功構(gòu)建重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP，為下一步感染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(ratmesenchymalstemcells，rMSCs)及基因治療脊髓損傷(spinalcordinjury，SCI)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分hBDNF基因修飾的大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的獲取及鑒定 目的:將構(gòu)建好的重組腺病毒載體Ad5-h

4、BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)hBDNF蛋白的表達(dá)從而獲得有生物活性hBDNF修飾的rMSCs(hBDNF-rMSCs)。 方法:提取SD大鼠新鮮骨髓，體外分離、培養(yǎng)rMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)rMSCs表面標(biāo)記物；重組腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP轉(zhuǎn)染第三代大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號(hào)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，RT-PCR法檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染rMSCs后hBDNFmRNA的表達(dá)，Weste

5、mblotting法測(cè)定hBDNF的表達(dá)水平。 結(jié)果:成功提取、分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增rMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD45表達(dá)陰性，CD29、CD90表達(dá)陽性。重組腺病毒轉(zhuǎn)染rMSCs后熒光激發(fā)可見綠色熒光信號(hào)，隨腺病毒載體感染復(fù)數(shù)(multipleofinfection，MOI)增加，rMSCs熒光表達(dá)增強(qiáng)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI=100時(shí)，熒光顯微鏡下所有細(xì)胞可見熒光信號(hào)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示rMSCs轉(zhuǎn)染率隨MOI的增加而增加

6、，當(dāng)MOI=100時(shí)其轉(zhuǎn)染率為100％；hBDNF-rMSCs的hBDNFmRNA及hBDNF的表達(dá)水平均隨腺病毒載體感染復(fù)數(shù)的增加而增加，當(dāng)感染復(fù)數(shù)MOI=100時(shí)，表達(dá)水平達(dá)到高峰，3～10天為表達(dá)高峰期。 結(jié)論:Ad5-hBDNF-EGFP成功轉(zhuǎn)染rMSCs，獲取hBDNF-rMSCs基因工程干細(xì)胞，該細(xì)胞可大量表達(dá)hBDNFmRNA及hBDNF蛋白，為下一步hBDNF-rMSCs移植治療大鼠脊髓損傷奠定了基礎(chǔ)。

7、第三部分hBDNF-rMSCs靜脈移植治療大鼠脊髓損傷 目的:hBDNF-rMSCs基因工程干細(xì)胞經(jīng)靜脈注射移植入脊髓損傷大鼠，觀察其在脊髓內(nèi)存活、基因表達(dá)情況，及對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。 方法:采用改良Allen法制備大鼠胸10脊髓損傷模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組、空載體-rMSCs移植組及hBDNF-rMSCs移植組。模型建立3天后，對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射0.1M磷酸鹽緩沖液(PBS)1m

8、l，hBDNF-rMSCs組、空載體-rMSCs組分別經(jīng)尾靜脈注射hBDNF-rMSCs及空載體-rMSCs單細(xì)胞懸液1ml。各組大鼠于損傷后24h、靜脈注射后1、3、5W應(yīng)用BBB評(píng)分、皮層體感誘發(fā)電位評(píng)價(jià)治療前后的神經(jīng)功能狀況，通過熒光顯微鏡觀測(cè)rMSCs在體內(nèi)存活、分布情況，應(yīng)用Westem-blotting法測(cè)定損傷脊髓節(jié)段中hBDNF的表達(dá)，免疫組化技術(shù)檢測(cè)損傷脊髓節(jié)段內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)絲-200KD(NF-

9、200)、突觸素Ⅰ的表達(dá)變化情況，光電鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果:與對(duì)照組相比，空載體-rMSCs移植組及hBDNF-rMSCs移植組大鼠神經(jīng)功能改善明顯，hBDNF-rMSCs組改善最為顯著，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評(píng)分及皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)檢測(cè)結(jié)果均優(yōu)于其它兩組?？蛰d體-rMSCs組及hBDNF-rMSCs組在熒光激發(fā)下均見到EGFP陽性細(xì)胞在損傷脊髓節(jié)段存活，有綠色熒光表達(dá)。Wes

10、tern-blotting法檢測(cè)顯示hBDNF-rMSCs組大量表達(dá)hBDNF，其余各組均無hBDNF的表達(dá)。細(xì)胞移植后各組均有GFAP、NF-200及突觸素I免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞和纖維，hBDNF-rMSCs組表達(dá)水平最高。組織形態(tài)學(xué)觀察，與對(duì)照組相比，空載體-rMSCs及hBDNF-rMSCs移植組損傷區(qū)域脊髓結(jié)構(gòu)較完整、清晰。 結(jié)論:hBDNF基因修飾的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈移植后可向脊髓損傷處聚集并存活，表達(dá)hBDNF蛋白，