腺病毒介導(dǎo)的shRNA沉默大鼠IL-1β基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白細(xì)胞介素1（interleukin1，IL-1）是一個(gè)具有多種免疫調(diào)節(jié)功能、可以誘發(fā)炎性反應(yīng)以及機(jī)體防御反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子。它可以活化T細(xì)胞（間接活化B細(xì)胞）、提高黏附分子表達(dá)、誘導(dǎo)一系列其它促炎性細(xì)胞因子以及炎性相關(guān)蛋白表達(dá)，形成炎性反應(yīng)的放大級聯(lián)反應(yīng)。大量證據(jù)證明：在免疫和心理應(yīng)激后產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）在神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和行為應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。特別是中樞系統(tǒng)產(chǎn)生的IL-1，它是應(yīng)激誘導(dǎo)的HPA軸的激

2、活和糖皮質(zhì)激素分泌之間的重要聯(lián)結(jié)，而糖皮質(zhì)激素在調(diào)節(jié)記憶功能和神經(jīng)可塑性上發(fā)揮著重要的影響，低濃度時(shí)發(fā)揮著有益的結(jié)果，高濃度時(shí)產(chǎn)生有害影響。此外，IL-1信號通路和糖皮質(zhì)激素分泌產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)急性和慢性應(yīng)激引起的抑郁癥狀，通過抑制海馬神經(jīng)元發(fā)生改善抑郁癥狀。然而，在一些生理?xiàng)l件下，比如低水平的IL-1，可以促進(jìn)適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)，這些反應(yīng)是有益的，但是在一些嚴(yán)重或慢性應(yīng)激條件下，沉默或阻止IL-1可以作為一種預(yù)防性和治療性的手段去緩解一些神經(jīng)

3、病理學(xué)和精神病理學(xué)疾病的問題。
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指外源或內(nèi)源性的短雙鏈RNA（dsRNA）進(jìn)入細(xì)胞后引起的同源mRNA的將解，從而特異性阻斷目的基因的表達(dá)。推測可能分為以下階段：首先雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被RNA酶Ⅲ（Ribonuclase Ⅲ，RNase Ⅲ）酶切成約21~23nt的小片段干擾RNA（short interfering RNA，siRNA），siRNA與一些蛋白組裝形成s

4、iRNA-蛋白復(fù)合物，即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC)。在ATP存在的情況下，雙鏈的siRNA解旋，解旋后的siRNA反義鏈引導(dǎo)RISC到達(dá)靶mRNA，并與之結(jié)合將其降解。本研究通過構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的siRNA干擾載體，用于沉默IL-1β基因的表達(dá)，為下一步基因功能和治療手段的研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的：本研究通過構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)IL-1βshRNA表達(dá)載體，來抑制IL-1β

5、的表達(dá)，以此探討IL-1β基因的功能與一些神經(jīng)病理學(xué)之間的關(guān)系。為腺病毒作為基因治療的載體提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.利用在線軟件設(shè)計(jì)特異性的IL-1β-siRNA寡核苷酸片段，在體外構(gòu)建和克隆重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IL-1β-shRNA.2.PmeI酶切線性化轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BJ5183pAdEasy-1中，進(jìn)行同源重組。3.篩選陽性重組腺病毒載體Ad-IL-1β-shRNA，PacI酶切后轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中包

6、裝病毒顆粒，得到腺病毒。并在體外巨噬細(xì)胞中檢測沉默效率。4.將腺病毒注射入大鼠體內(nèi)，觀察對大鼠體重和糖水偏嗜度的影響，并檢測大鼠組織中mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.經(jīng)酶切和序列測序證明成功構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-IL-1β-shRNA2.成功構(gòu)建了腺病毒載體Ad-IL-1β-shRNA并在HEK293細(xì)胞中完成了包裝。3.在體外，腺病毒1和腺病毒2感染巨噬細(xì)胞后，使其IL-1βmRNA表達(dá)水平明顯降低，分別下降了