Rac1在肺腺、鱗癌中的表達(dá)和意義.pdf

1、前言：肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在我國許多地區(qū)惡性腫瘤的死亡率統(tǒng)計中肺癌占首位。侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌的重要生物學(xué)特征之一，也是決定肺癌預(yù)后的重要關(guān)鍵因素。Rac1是Rho家族中重要成員之一，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與肺癌的關(guān)系尚不清楚。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法及RT-PCR技術(shù)檢測肺癌組織及癌旁組織中Rac1的表達(dá)狀況，探討其表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系。 方法：1.采用免疫組織化學(xué)S-P方法檢測肺癌組織中Rac

2、1的表達(dá)。所用非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本為中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2003年11月-2004年9月外科手術(shù)切除原發(fā)性肺癌80例，標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋。另收集新鮮肺癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本30例，術(shù)后立即放入-70℃冰箱保存，用于RT-PCR，患者術(shù)前均未接受過放化療。免疫組化染色方法采用鏈霉菌抗生物素過氧化物酶連接法?？筊ac1鼠抗人單克隆IgG抗體購自美國SantaCrutz公司，TRIZOL總RNA提取試劑購自美國Invi

3、trogen公司，SP染色試劑盒、DAB顯色液為福州邁新公司產(chǎn)品。免疫組化染色操作按常規(guī)SP染色步驟進(jìn)行。 以正常支氣管粘膜上皮細(xì)胞染色為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，每高倍視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞，無著色為(-)，陽性細(xì)胞數(shù)≤25％為(+)，26～75％為(++)，≥76％為(+++)。Rac1正常為不表達(dá)或弱表達(dá)，而在癌組織中出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)。我們參考Horiuchi對卵巢癌中RhoGTP

4、酶免疫組化檢測的結(jié)果，將Rac1胞漿表達(dá)(-)～(+)定義為表達(dá)正常，將(++)～(+++)定義為過度表達(dá)。 2.RT-PCR采用TRIZOL試劑一步法提取RNA，按說明書操作，提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，(Rac1的上游引物為5’-ATCAAGTGTGTGGTGGTGGGAG-3’、下游引物為5’-ACAGCACCAATCTCCTTAGCCA-3’，β-actin的上游引物為5’-TGTATGCCTCTGGTACCAC

5、-3’、下游引物為5’-ACAGAGG-TACTTGCGCTCTCAGGAG-3’均為塞百盛基因公司產(chǎn)品)直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃2分鐘后，94℃30秒，50-65℃30秒，72℃0.5-4分鐘25-35個循環(huán)。Rac1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以100bpDNAMarker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(UvpBiolmagineSystem，美國)，測定擴(kuò)增帶整合光密度值，以β-actin內(nèi)參

6、照值標(biāo)準(zhǔn)化Rac1值，得到Rac1mRNA的相對含量。 3.統(tǒng)計學(xué)方法(1)S-P法所得的各組計數(shù)資料利用SPSSforWindow10.0軟件包，采用Pearson卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 (2)RT-PCR結(jié)果參照β-actin的灰度值，配對t檢驗分析Rac1的表達(dá)情況。 結(jié)果1.免疫組化染色結(jié)果：Rac1在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)Rac1在正常肺組織及支氣管上皮細(xì)胞中均弱表達(dá)，而在非小細(xì)

7、胞肺癌中Rac1出現(xiàn)過表達(dá)(圖1)，其過表達(dá)率為65％(52/80)。鱗癌中Rac1的過表達(dá)率63％(24/38)，腺癌中的過表達(dá)率為66％(28/42)；高中分化的病例中Rac1過表達(dá)率為57％(31/54)，明顯低于低分化病例中的過表達(dá)率81％(21/26)。Ⅰ、Ⅱ期病例中Rac1過表達(dá)率為65％(37/57)，Ⅲ、Ⅳ期病例中的過表達(dá)率為65％(15/23)。在32例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，有18例(56％)出現(xiàn)了Rac1的過表達(dá)，而在

8、48例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，有34例(70％)出現(xiàn)了Rac1的過表達(dá)。Rac1的高表達(dá)僅與肺癌的組織學(xué)分化程度有關(guān)，而與年齡、性別、組織學(xué)分型、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)性。 2.RT-PCR結(jié)果Rac1總mRNA在肺鱗、腺癌組織中相對表達(dá)量明顯高于正常組織(P＜0.05)，但其表達(dá)與癌組織的分型、分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。 討論1.Rac1與腫瘤的關(guān)系Rac1是一種小分子GTP結(jié)合蛋白，國內(nèi)外的研究

9、表明，Rac1在人類正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。本研究中，癌旁組織內(nèi)無表達(dá)或低表達(dá)，與文獻(xiàn)報道一致。 2.Rac1與臨床病理因素之間的關(guān)系實驗研究中發(fā)現(xiàn)在免疫組化染色實驗中，Rac1的高表達(dá)僅與肺癌的組織學(xué)分化程度(P=0.04＜0.05)有關(guān)，而與年齡、性別、組織學(xué)分型、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)性；而30例RT-PCR結(jié)果是Rac1總mRNA在肺鱗、腺癌組織中相對表達(dá)量明顯高于正常組織(P＜0.05)，但其表達(dá)與癌組織

10、的分型、分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。肺癌組織中的總mRNA高于正常肺組織提示細(xì)胞中Rac1的高表達(dá)與肺癌的發(fā)生有明確的關(guān)系，驗證了Rac1在肺癌的瘤組織中呈高表達(dá)的結(jié)論；而與組織分化程度沒有明確相關(guān)性這一點(diǎn)上與免疫組化結(jié)果分析得出的結(jié)論相反，本人認(rèn)為可能與在組織切片的免疫組化結(jié)果判定存在一定的主觀性，腫瘤的組織分型、分化程度的判定上可能存在不夠準(zhǔn)確，而且將免疫組化實驗數(shù)據(jù)做Pearson卡方檢驗時將中、高分化腫瘤的統(tǒng)計結(jié)果放