Rac1調(diào)控香煙誘導肺上皮細胞—間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變.pdf

1、研究背景和研究目的:肺癌和慢性阻塞性肺炎(COPD)是影響人類生活質(zhì)量的全球性健康問題，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變(EMT)是COPD和肺癌的重要病理生理過程。我們推測吸煙可能是引起EMT的重要因素。香煙含有大量的氧化物質(zhì)，這些氧化物質(zhì)能激活Rac1。Rac1是Rho家族中的一種小G蛋白，其影響細胞的生存、遷移、骨架重排和代謝，并且Rac1的敲除能夠有效地抑制細胞的遷移和侵襲。雖然有研究證明Rho信號途徑在TGF-

2、β1所誘導的遷移中的作用，以及Smad信號在EMT的調(diào)控作用，但是有關(guān)Rac1在香煙誘導的EMT中的調(diào)節(jié)作用，則尚未見有報道。因此，本課題就香煙能否誘導EMT及誘導過程的關(guān)鍵因子和信號途徑加以研究。
　　 方法:
　　 1) MTT法檢測CSE對A549細胞活性的影響;
　　 2)用CSE誘導EMT，用Q-PCR、Elisa、western blot、細胞免疫熒光染色等方法測定EMT指標如轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-β

3、1)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、α-肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白(vimentin)，和顯微鏡檢測細胞形態(tài);
　　 3)用抗TGF-β1中和抗體(ATNA)阻斷TGF-β1與其Ⅱ型受體相結(jié)合，確認TGF-β信號通路在CSE誘導的EMT中的作用;
　　 4)采用Rac活性試驗檢測CSE對Rac1信號分子的影響，接下來用Rac1的抑制劑(NSC23766，NSC)抑制Rac1

4、的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因，來探究Rac1在CSE誘導的EMT中的作用;
　　 5) NSC抑制Rac1的活性或Rac1 siRNA沉默Rac1基因后，采用westem blot法來檢測Rac1對CSE誘導的Akt、Smad2以及P38活性的影響;
　　 6)用PI3K的抑制劑(LY294002)和Akt的抑制劑(MK-2206)分別抑制PI3K和Akt的活性以及Erk1/2抑制劑(U0126)、JNK

5、抑制劑(SP600125)、p38抑制劑(SB203580)阻斷Erk1/2、JNK和P38，進一步研究CSE誘導EMT的信號機制。
　　 結(jié)果:
　　 1)細胞活力檢測:不同濃度的CSE(0.1％～3％)與肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549)培養(yǎng)24、48、72小時，呈濃度和時間依賴引起A549細胞毒反應和減少細胞的存活率;
　　 2) CSE誘導肺上皮細胞TGF-β1的表達:不同濃度的CSE(0.1％～2.5％)刺激

6、A549細胞24、48、72小時，Q-PCR和Elisa檢測發(fā)現(xiàn)CSE呈濃度和時間依賴誘導肺上皮細胞表達TGF-β1，CSE暴露刺激48小時，可導致細胞形態(tài)發(fā)生改變、EMT相關(guān)因子的表達變化，并且低濃度的CSE和低濃度的TGF-β1聯(lián)合處理細胞時可以協(xié)同誘導EMT現(xiàn)象;
　　 3)用ATNA阻斷TGF-β1與其Ⅱ型受體相結(jié)合，能抑制CSE誘導的EMT相關(guān)因子的表達變化（抑制E-cadherin表達的下調(diào)以及TGF-β1、vime

7、ntin、α-SMA表達的上調(diào)），這些數(shù)據(jù)證實CSE誘導EMT通過TGF-β1的聚集及其下游信號通路的激活;
　　 4) ATNA/NSC可阻斷CSE誘導的Rac1的激活，這顯示CSE激活Rac1依賴于TGF-β1的聚集，并且抑制Rac1的活性或其表達可顯著抑制CSE誘導的EMT現(xiàn)象;
　　 5) CSE呈濃度依賴性誘導Akt的磷酸化，抑制Rac1活性或者其表達可抑制CSE誘導的Akt、Smad2的激活，但對P38的磷酸

8、化無明顯影響。PI3K和Akt的抑制劑能顯著抑制EMT相關(guān)因子的表達變化，而MEK、P38、JNK抑制劑不能抑制這種現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 綜上結(jié)果提示，CSE刺激人的肺上皮細胞可引起EMT形態(tài)學和相關(guān)因子的變化與增加TGF-β1表達直接相關(guān)，siRac1干預和Rac1抑制劑處理可減少TGF-β1表達，也能抑制Akt、Smad信號途徑，提示Akt/Smad2是Rac1的下游分子。我們的研究表明Rac1可能是治療COP