胚胎大鼠海馬神經(jīng)干細胞的擴增及其與三維微小凹圖式復(fù)合的研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多潛能干細胞，在神經(jīng)發(fā)育及損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但其相關(guān)研究的關(guān)鍵在于干細胞的獲取及有效擴增方法的建立。神經(jīng)干細胞的擴增包括普通培養(yǎng)條件下的擴增以及在特定條件下于三維支架材料上的擴增。文獻報道神經(jīng)干細胞在三維支架材料上的擴增、形態(tài)及離子通道功能表達均不同于普通二維培養(yǎng)條件下的行為特征，且更接近于體內(nèi)條件下的功能特點。因此，本課題研究了海馬干細胞的有效提取

2、方法及其與三維微結(jié)構(gòu)PLLA的復(fù)合情況。
　　 目的：比較2種培養(yǎng)基下海馬神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)的生長特性，實現(xiàn)海馬神經(jīng)干細胞(NSCs)擴增的優(yōu)化及其與聚乳酸（PLLA）三維微小凹圖式的復(fù)合，初步篩選有利用于神經(jīng)干細胞復(fù)合和干細胞特性維持的三維微結(jié)構(gòu)構(gòu)型。
　　 方法：分離大鼠胚胎海馬細胞并采用Neurobasal為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基、DMEM∕F12為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基進行擴增。以四甲基氮唑藍

3、(MTT)比色法及神經(jīng)球數(shù)目統(tǒng)計法評價2種培養(yǎng)基下細胞增殖行為。采用紫外光光刻、硅蝕刻及軟光刻技術(shù)制備PLLA三維微小凹圖式并實現(xiàn)海馬NSCs與微小凹圖式的復(fù)合。采用光學(xué)顯微鏡檢測細胞在微小凹圖式上的生長行為，及免疫熒光法鑒定其在不同三維結(jié)構(gòu)下的分化情況。
　　 結(jié)果：原代分離的海馬細胞呈神經(jīng)干細胞標志物nestin陽性并能向神經(jīng)元系和膠質(zhì)細胞系分化。在30 d的擴增時間內(nèi)，海馬神經(jīng)干細胞在以Neurobasal為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中

4、緩慢擴增聚集成神經(jīng)球，少見細胞貼壁及分化；在以DMEM∕F12為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中海馬神經(jīng)干細胞擴增迅速，但易貼壁和分化。培養(yǎng)第25天時后者神經(jīng)球數(shù)量為前者的4.7倍。因此，序貫應(yīng)用兩種培養(yǎng)基可以實現(xiàn)海馬干細胞的有效擴增。微加工制備的微小凹圖式結(jié)構(gòu)清晰、穩(wěn)定，具有高縱橫結(jié)構(gòu)比（≥1）。擴增的海馬神經(jīng)干細胞能在三維微小凹圖式上成功復(fù)合生長，微結(jié)構(gòu)中微小凹直徑以及通道的有無和寬度明顯影響微結(jié)構(gòu)中細胞生長的數(shù)量。隨著微小凹直徑的增大，微結(jié)構(gòu)中生長

5、的細胞數(shù)量相應(yīng)增多；隨著微小凹之間通道結(jié)構(gòu)的引入以及通道寬度從20μm增加至40μm，細胞生長的數(shù)量也相應(yīng)增多。無通道微結(jié)構(gòu)中的細胞基本無神經(jīng)突起的伸出；有通道微結(jié)構(gòu)中的細胞伸出大量的神經(jīng)突起，且突起沿微通道方向延伸。
　　 結(jié)論：以DMEM∕F12為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基有利于大鼠海馬NSCs的擴增，以Neurobasal為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基利于海馬NSCs的純化。序貫應(yīng)用2種培養(yǎng)基可有效擴增海馬神經(jīng)干細胞并實現(xiàn)其與三維微小凹圖式的復(fù)合。沒有