七氟烷對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的活性、增殖、分化的影響及其可能機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討不同濃度七氟烷對(duì)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(Fetal neural stem cells,FNSC)的活性、增殖及分化的影響，并初步探索其機(jī)制，為臨床上七氟烷運(yùn)用的選擇和管理提供一定的指導(dǎo)意義。
　　方法：
　　購得Invitrogen公司從胚胎14天SD大鼠皮層中取出的神經(jīng)干細(xì)胞，使用神經(jīng)干細(xì)胞完全無血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）進(jìn)行培養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均選用第2-4代FNSC進(jìn)行，選用

2、胚胎神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin以及Sox2進(jìn)行免疫熒光鑒定，可知培養(yǎng)的第4代FNSC未分化表型仍維持在90％以上。
　　1.單層貼壁培養(yǎng)FNSC，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（C組），即單純吸入21%O2，5%CO2以及平衡N2未吸入七氟烷組；根據(jù)吸入七氟烷濃度不同，實(shí)驗(yàn)組分為：低濃度七氟烷組（SL組，吸入1.2%即0.5MAC七氟烷）；中濃度七氟烷組（SM組，吸入2.4%即1MAC七氟烷）；以及高濃度七氟烷組（SH組，吸入4.8%

3、即2MAC七氟烷）。以上4組FNSC于處理6h，12h及24h后用MTT方法檢測(cè)FNSC活細(xì)胞數(shù)的變化。
　　2.利用Annexinn V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SH組處理不同時(shí)間（6h，12h，24h）對(duì)FNSC細(xì)胞凋亡的影響，Western blotting法檢測(cè)凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase-3以及凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax的水平，進(jìn)一步明確七氟烷誘導(dǎo)FNSC細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　3.由于FNSC具有增殖和

4、自我分化的特性，采用EdU插入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C組、SL組、SM組以及SH組暴露6h對(duì)FNSC增殖的影響；另一批FNSC于藥物處理結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24h，采用Sox2免疫熒光染色檢測(cè)七氟烷對(duì)FNSC分化的影響。
　　4.利用Western blotting法檢測(cè)SH組處理不同時(shí)間（6h，12h，24h）后FNSC中p-JNK以及JNK蛋白表達(dá)變化，推測(cè)七氟烷對(duì)FNSC的活性、增殖、分化影響的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.與C組

5、相比，SL組處理不同時(shí)間（6h，12h，24h）后FNSC細(xì)胞活性無明顯影響（P>0.05）；SM組24h可誘導(dǎo)FNSC活細(xì)胞數(shù)降低，有顯著性差異（P<0.0001）；SH組暴露6h、12h以及24h均可誘導(dǎo)FNSC活細(xì)胞數(shù)降低，且呈時(shí)間依賴性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.與C相比，SH組處理12h、24h可誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）， SH各時(shí)間組（6h，12h，24h）之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

6、<0.05）；SH24h組與C組比較cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，12h及24h組bcl-2/bax水平降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.與C組相比，SL組以及SM組暴露6h對(duì) FNSC的增殖和分化無顯著影響（P>0.05），而SH組6h可抑制FNSC的增殖，誘導(dǎo)其自發(fā)分化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　4.與C組相比，SH組可上調(diào)p-JNK蛋白表達(dá)水平，而對(duì)總的JNK蛋白無明顯