激活素A及卵泡抑素對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：觀察激活素A(ActivinA，ACT-A)及其抑制劑卵泡抑素(Follistain，F(xiàn)S)對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)的影響，以探討ACT-A在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制中的作用。 方法：無(wú)菌條件下取體重100-120g雄性SD大鼠腎臟，剪除腎臟表面包膜及腎皮質(zhì)，剪碎剩余的腎組織經(jīng)酶消化法原代培養(yǎng)。應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和電鏡技術(shù)，鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為大鼠腎

2、間質(zhì)成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為以下各組： (一)A組：各濃度ACT-A單獨(dú)作用 1.0ng/mlACT-A2.0.3ng/mlACT-A3.3ng/mlACT-A4.30ng/mlACT-A5.100ng/mlACT-A (二)F組：各濃度FS單獨(dú)作用 1.0ng/mlFS2.0.3ng/mlFS3.3ng/mlFS4.30ng/mlFS5.100ng/mlFS (三)A+F組：30ng/mlACT-A

3、+不同濃度FS聯(lián)合作用 1.30ng/mlACT-A+0ng/mlFS2.30ng/mlACT-A+0.3ng/mlFS3.30ng/mlACT-A+3ng/mlFS4.30ng/mlACT-A+30ng/mlFS5.30ng/mlACT-A+100ng/mlFS 給予各組細(xì)胞不同的刺激后，檢測(cè)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖情況，Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)、Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，ColⅣ)、羥脯氨酸(h

4、ydroxyproline，HYP)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha-smoothmuscleactin，α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)的表達(dá)。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖情況采用四甲基偶氮唑鹽(Methylthiotetrazole，MTT)比色法檢測(cè)。ColⅠ、TGF-β1、α-SMA、FNmRNA的表達(dá)采用半定量逆轉(zhuǎn)錄

5、-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測(cè)。α-SMA、Ⅰ型膠原、TGF-β1表達(dá)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中FN、Ⅳ型膠原的含量。羥脯氨酸試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中HYP的含量。 結(jié)果： 1.原代培養(yǎng)的大鼠腎間質(zhì)細(xì)胞，倒置顯微鏡下呈梭型生長(zhǎng)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞波形蛋白(vimentin)陽(yáng)性，角蛋白(

6、keratin)陰性；電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大量微絲、高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，證明我們所培養(yǎng)的細(xì)胞是大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。 2.MTT法測(cè)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明：ACT-A在0.3～30ng/ml范圍內(nèi)，以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖；在所研究的劑量范圍內(nèi)，30ng/mlACT-A促進(jìn)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)，當(dāng)ACT-A濃度為100ng/ml時(shí)，刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖的作用反而減弱。單純加入

7、FS，在所觀察的濃度范圍內(nèi)，對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，但FS以劑量依賴(lài)方式抑制ACT-A的促大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖作用。 3.半定量RT-PCR法擴(kuò)增FN、ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA(481bp、487bp、303bp、222bp)。結(jié)果表明：ACT-A在0.3～100ng/ml范圍內(nèi)，以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA，而對(duì)FNmRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯

8、影響。單純加入FS，在所觀察的濃度范圍內(nèi)，對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)ColⅠ、TGF-β1、α-SMA、FNmRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯影響；但FS以劑量依賴(lài)方式抑制ACT-A的促大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)ColⅠ、TGF-β1、α-SMAmRNA的作用，對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)FNmRNA沒(méi)有影響。 4.檢測(cè)培養(yǎng)液中FN和Ⅳ型膠原濃度以及HYP含量。結(jié)果表明：在0.3～100ng/ml范圍內(nèi)，ACT-A濃度越高，培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原濃度

9、和HYP含量也越高，呈劑量依賴(lài)關(guān)系；對(duì)FN濃度無(wú)明顯影響。在所觀察的濃度范圍內(nèi)，單純加入FS對(duì)大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原和FN濃度沒(méi)有影響，但以劑量依賴(lài)方式抑制ACT-A促大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原及分泌HYP的作用。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。 2.ACT-A刺激體外培養(yǎng)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化，并使ECM產(chǎn)生增多，提示ACT-A是重要的致纖維化因子，可能參與了慢性腎