Mas基因沉默對(duì)血管緊張素-(1-7)拮抗血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響.pdf

1、 目的：探討Mas基因沉默后對(duì)血管緊張素-(1-7) [angiotensin-(1–7),Ang-(1-7)]拮抗血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NRK-49F)活化的影響。方法：在體外傳代培養(yǎng)NRK-49F,當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)至 70-80%融合后,用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液并接種于六孔板中用于實(shí)驗(yàn)。在我們的前期實(shí)驗(yàn)中根據(jù) Mas 基因序列設(shè)計(jì)合成 3 對(duì)不同位

2、點(diǎn)的小分子干擾 RNA(small interfering RNA , SiRNA)并采用 HiPerFect Transfection Reagent 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 NRK-49F , 48h 后通過(guò)用半定量PCR(semi-quantitative PCR,RT-PCR)法檢測(cè)Mas mRNA的表達(dá)和用蛋白免疫印記法(Western blot)檢測(cè) Mas 蛋白的表達(dá),已證實(shí) Mas SiRNA能有效的沉默Mas基因的表達(dá)并篩選出了對(duì)M

3、as基因沉默效果最佳的一對(duì)Mas SiRNA序列。為進(jìn)一步研究有效Mas SiRNA沉默Mas基因后對(duì)Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的NRK-49F活化的影響,我們將已篩選出的有效序列Mas SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NRK-49F,根據(jù)不同的干預(yù)因素實(shí)驗(yàn)分為6組：①正常對(duì)照組(NG)：細(xì)胞中僅加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基,即正常培養(yǎng)基,②AngⅡ組：細(xì)胞中加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ的正常培養(yǎng)基,③A

4、ng-(1-7)組：細(xì)胞中加入含終濃度為 10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基,④AngⅡ+ Ang-(1-7)組：細(xì)胞中同時(shí)加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ和終濃度為 10-5mol/LAng-(1-7) 的正常培養(yǎng)基,⑤陰性 SiRNA 對(duì)照組：細(xì)胞在陰性序列 siRNA 轉(zhuǎn)染 48h 后加入含 10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基,⑥Mas SiRNA轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞在

5、有效 Mas siRNA 轉(zhuǎn)染 48h 后加入含 10-6mol/L AngⅡ和 10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基。將上述各組細(xì)胞分別培養(yǎng)72h后,采用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè) NRK-49F 活化標(biāo)志物 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)上清液中細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)的含量。結(jié)果：細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果表明有

6、效 Mas SiRNA 轉(zhuǎn)染組在加 AngⅡ+Ang-(1-7)干預(yù)72h后,顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞肥大,細(xì)胞胞漿所占體積比例增多,在胞漿內(nèi)能觀察到棕黃色顆粒,界限清楚,與AngⅡ組的細(xì)胞形態(tài)相似,經(jīng)半定量分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示較非轉(zhuǎn)染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性 SiRNA 轉(zhuǎn)染組 α-SMA 表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而AngⅡ+ Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組α-SMA的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05),正

7、常對(duì)照組與 Ang-(1-7)組幾無(wú) α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞加AngⅡ+Ang-(1-7)干預(yù)72h后,有效Mas SiRNA轉(zhuǎn)染組較非轉(zhuǎn)染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中 ColⅠ的含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉(zhuǎn)染組上清液中ColⅠ的含量無(wú)明顯差異(P>0.05),正常對(duì)照組與Ang-(1-7)組細(xì)胞上清液中僅