靶向siRNA體外抑制大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞MAS 基因表達的研究.pdf

1、 目的：探討體外直接轉(zhuǎn)染以大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞(NRK-49F) MAS基因為靶標的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)后, NRK-49F的MAS基因的mRNA表達和蛋白水平是否受到抑制,篩選出高效的siRNA,為進一步研究MAS基因在腎臟疾病中的作用機制提供實驗基礎。方法：(1)靶向MAS基因的siRNA的設計及合成：通過NCBI檢索大鼠MAS基因序列,按照siRNA序列設計原則設計并合成特異性沉默

2、MAS的siRNA3對：siRNA-1(5'-CCUGACCAGA GCUUUCAAATT-3',5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3')、siR NA-2(5'- GACCAAUCAAAUAUGACAUTT - 3',5'- AUGUCAUA UUUGAUUGGUCTT-3')、siRNA-3(5'-GCCAUUACUACACAAUC GUTT-3',5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3')；陰性對照s

3、iRNA (siRNA-neg)(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',5'-ACGU GACACGUUCGGAGAATT-3')1對。(2)細胞培養(yǎng)：NRK-49F細胞置于DMEM /F12培養(yǎng)基中(含有l(wèi)0%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素),在37℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中,用0.25%胰酶消化傳代,待細胞懸液內(nèi)的細胞呈對數(shù)生長后,將細胞制成1×105/ml的細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板進行實驗

4、。(3)實驗分組：①MAS siRNA-1 ： 加 入 含 siRNA 序 列 1 的 轉(zhuǎn) 染 混 合 物(transfection complexes,TC)；②MAS siRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MAS siRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④ 陰性對照組(CG)：加入含siRNA陰性序列的TC；⑤ 空白對照組(NG)：只加入轉(zhuǎn)染試劑；每組設3個復孔。(4)轉(zhuǎn)染：將HiPerFect Transfecti

5、on Reagent 12ul與無血清無雙抗培養(yǎng)液混合,配成100ul轉(zhuǎn)染液后,再加入終濃度為10nM的siRNA,兩者混勻常溫孵育5-10分鐘。將轉(zhuǎn)染混合物加入六孔板中,輕輕晃動保證轉(zhuǎn)染混合物分布均勻,恒溫箱中孵育,48小時后檢測轉(zhuǎn)染效率。(5)基因表達檢測：應用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應( rever-setranscription -polymerase chain reaction , RT-PCR)與蛋白質(zhì)印跡法(Western

6、blot)檢測轉(zhuǎn)染前后MAS的mRNA與蛋白表達的變化。(6)圖像處理：采用Quantity One 4.4.0軟件測定各組灰度值。(7)統(tǒng)計分析：應用軟件spss17.0進行統(tǒng)計學分析,通過單因素方差分析檢驗各組間差異性,P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：經(jīng)siRNA干擾后,3條靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表達。RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示siRNA-1組、siRNA-2組及siRNA-3組NRK-49F細胞MAS

7、的mRNA水平與空白對照組相比顯著降低(P〈0.05) , 各組 MAS 與 GAPDH 灰度值的比值分別為0.5772±0.0220 , 0.3380±0.0434 , 0.6164±0.0767 ,抑制率分別達到26.89%,57.12%,21.73%,而陰性對照組和空白對照組之間mRNA的表達水平比較則無顯著下降。Western blot 方法檢測結(jié)果顯示：3條靶向MAS的特異性序列siRNA蛋白表達水平與空白對照組相比顯著降低(