鞘脂代謝物對維甲酸類藥物腫瘤抑制過程中的影響.pdf

1、研究背景:
　　 鞘脂是真核細胞膜的主要成分，能代謝產(chǎn)生多種重要的信號分子。在鞘脂代謝物中，神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘氨醇磷酸(S1P)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Cer具有腫瘤抑制作用，能夠抑制腫瘤細胞增長、促進細胞凋亡;而S1P則被認為具有促癌作用。細胞內(nèi)Cer和S1P的動態(tài)平衡往往決定著細胞是處于增殖還是凋亡狀態(tài)。
　　 維甲酸類藥物是維生素A的結(jié)構(gòu)及功能類似物的總稱，這類物質(zhì)對于調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用

2、。維甲酸類藥物的作用主要由核內(nèi)受體維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)介導，通過激活RAR/RXR二聚體促進含有RXRs或RARs識別元件的靶基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。維甲酸受體的表達缺失是癌癥發(fā)生過程中的常發(fā)與重要事件，這可能導致腫瘤對維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性。除了促進靶基因轉(zhuǎn)錄外，維甲酸受體RXRα還可能進入細胞質(zhì)發(fā)揮重要作用，其中RXRα與孤兒受體TR3以二聚體形式進入胞質(zhì)，引起細胞凋亡，這被認為是非常重要的促進細胞凋亡途徑之一。

3、r>　　 本課題主要進行以下方面的研究:(1)Cer是否通過RXRα出核機制誘導細胞凋亡？(2)S1P對維甲酸類藥物腫瘤抑制作用的影響及產(chǎn)生機制。
　　 該項研究的對于深入了解鞘脂類代謝產(chǎn)物影響維甲酸受體胞內(nèi)定位，功能改變和信號通路的異常傳導十分重要，同時其發(fā)現(xiàn)的S1P介導腫瘤產(chǎn)生對維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性、發(fā)現(xiàn)新靶點和設(shè)計維甲酸衍生物具有指導意義。
　　 實驗方法:
　　 1.Cer促進RXRα出核的意義

4、>　　 以免疫熒光染色法檢測人肝癌SMMC-7721和肺癌H460細胞內(nèi)源性RXRα在Cer作用下的胞內(nèi)定位變化，以Westernblotting法確認細胞中Cer促使RXRα出核現(xiàn)象。以瞬時轉(zhuǎn)染法檢測外源性表達的GFP-RXRα在Cer作用下能否由核內(nèi)遷移進入胞質(zhì)。以熒光素酶報告基因法分析293A細胞中Cer能否拮抗9-cis-RA促進RAR/RXR對含有維甲酸識別元件(RARE)的報告基因轉(zhuǎn)錄水平。以MTT法分析Cer抑制SMMC

5、-7721與SMMC-7721/RXRα細胞生長程度的差異。以Westernblotting法檢測SMMC-7721和H460細胞中不同時間點的RXRα表達量及cleavedPARP表達變化。
　　 2.S1P引起腫瘤細胞對維甲酸類藥物耐藥的機制研究
　　 以MTT法檢測不同濃度S1P對SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞生長的影響，以流式細胞儀檢測S1P能否解除全反式維甲酸(ATRA)所致的細胞G1期阻滯作用。以

6、Westernblotting法和實時定量PCR法檢測S1P對ATRA誘導細胞RARβ表達的影響，以熒光素酶報告基因檢測法分析S1P能否拮抗ATRA對含有RARE的報告基因的轉(zhuǎn)錄促進作用。
　　 以免疫熒光染色和瞬時轉(zhuǎn)染法分析細胞中RXRα和鞘氨醇激酶2(Sphk2)定位的一致性，以免疫共沉淀法檢測Sphk2和RXRα能否結(jié)合。在HT-29細胞中瞬時轉(zhuǎn)染HA-Sphk2和空載體，以Westernblotting法和半定量RT-P

7、CR法檢測外源表達的Sphk2能否抑制ATRA和RXR激動劑LGD1069促進RARβ轉(zhuǎn)錄和表達的作用，在293A和HT-29細胞中，以熒光素酶報告基因檢測法分析Sphk2能否抑制ATRA和9-cis-RA對含有RARE的報告基因的轉(zhuǎn)錄促進作用。
　　 以半定量RT-PCR法檢測蛋白酶體抑制劑MG132能否解除S1P抑制ATRA促進RARβ轉(zhuǎn)錄的作用。以Westernblotting法檢測RXRα在LGD1069和ATRA存在時

8、的蛋白降解能否被S1P增強，以及S1P促進對RARβ在ATRA存在時的修飾和降解。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.Cer能夠促進RXRα由細胞核遷移進入細胞質(zhì)
　　 在含有0.5％血清的培養(yǎng)基中，以10μM的Cer處理12小時后，H460和SMMC-7721細胞均出現(xiàn)凋亡特征，同時RXRα出核進入細胞質(zhì)中。Westernblotting實驗確認了Cer引起SMMC-7721細胞的RXRα出核現(xiàn)象。在SMMC-772

9、1細胞瞬時轉(zhuǎn)染GFP-RXRα，Cer處理10h后，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)RXRα已經(jīng)進入細胞質(zhì)中。
　　 2.Cer引起細胞凋亡的作用并不依賴于RXRα出核誘導凋亡這一途徑
　　 熒光素酶報告基因檢測實驗證明，Cer不影響9-cis-RA促進RXR/RAR對靶基因的轉(zhuǎn)錄。在建立的SMMC-7721/RXRα穩(wěn)定表達細胞中RXRα表達量明顯增高，而MTT結(jié)果顯示Cer對SMMC-7721/RXRα和SMMC-7721細胞生長抑制

10、作用差異并不顯著。在Cer誘導SMMC-7721細胞凋亡的過程中，3h時cleavedPARP明顯增多，至12h達高峰;而RXRα表達量在9h下降，第12h下降14.2％，這兩個時間點正是RXRα出核最明顯之處。Cer所致的RXRα降解在H460細胞中尤為明顯。
　　 3.S1P拮抗ATRA和LGD1069抑制細胞生長作用
　　 MTT結(jié)果顯示:與10μMATRA單獨作用比較，合用0.01或0.1μMS1P后，HT-29

11、細胞增殖水平分別增加了15.1％和26.2％，H460細胞增殖增加了14.0％和15.2％。與10μMLGD1069單獨作用相比，合用1μM的S1P時，A549細胞數(shù)增加33.5％，而HCT116細胞增加29.8％。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ATRA(5μM)能夠引起HT-29細胞G1期阻滯，合用S1P(0.1μM)，則能解除ATRA引起的細胞G1阻滯。
　　 4.S1P拮抗ATRA誘導RARβ表達作用
　　 Westernblo

12、tting結(jié)果顯示:ATRA(1μM)能使HT-29和SMMC-7721細胞RARβ表達量明顯增加，S1P則能抑制ATRA對RARβ表達的誘導作用。Real-timePCR結(jié)果顯示:S1P的上述拮抗作用具有時間依賴性。熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn):S1P濃度為0.001，0.01和0.1μM時，RARE轉(zhuǎn)錄活性與ATRA單獨作用相比分別下降7.8，19.4和37.3％。
　　 5.Sphk2與RXRα能結(jié)合并抑制ATRA和LGD10

13、69對RXR/RAR的激活
　　 與內(nèi)源性表達的Sphk2和RXRα相同，在HT-29細胞中轉(zhuǎn)染的HA-Sphk2和GFP-RXRα均位于核內(nèi)，而在TPA刺激下均進入胞質(zhì)中。以免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Sphk2與RXRα能夠結(jié)合，而Sphk1則不能與之結(jié)合。RT-PCR和Westernblotting結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染了Sphk2的細胞，ATRA和LGD1069誘導RARβ的轉(zhuǎn)錄和表達水平明顯減少。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明:隨著Sphk2

14、劑量增加，ATRA和9-cis-RA促進報告基因轉(zhuǎn)錄的作用隨之下降。
　　 6.S1P拮抗ATRA誘導RARβ表達作用與蛋白酶體降解途徑有關(guān)
　　 以半定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ATRA單獨作用相比，S1P和ATRA聯(lián)合作用時HT-29細胞RARβ的mRNA表達量下降了41.8％;而當ATRA，S1P和MG132聯(lián)合作用時，僅比ATRA單獨作用降低了7.7％。
　　 7.S1P促進維甲酸受體配體依賴性降解

15、>　　 Westernblotting結(jié)果證明:LGD1069單獨作用時RXRα產(chǎn)生了配體依賴性降解，當S1P與LGD1069聯(lián)合作用時，RXRα表達量進一步下降47.3％。ATRA能夠誘導RXRα的降解作用，但ATRA與S1P合用時RXRα的量比ATRA單獨作用時反而增加了91.7％，說明RARβ表達水平的降低可能導致RXRα不能被ATRA誘導降解。當ATRA和MG132合用時，在RARβ上方出現(xiàn)了新條帶，合用S1P后條帶加深。用抗

16、乙酰化賴氨酸抗體檢測發(fā)現(xiàn)ATRA和MG132合用時也出現(xiàn)了一條新條帶，當ATRA,MG132和S1P聯(lián)合作用時條帶也加深，初步推測是RARβ發(fā)生了乙?；揎棥?br>　　 實驗結(jié)論:
　　 1.由Cer引起的RXRα出核現(xiàn)象可能并不直接引起凋亡作用，其出核的直接作用可能與Cer誘導細胞凋亡時蛋白的降解作用有關(guān)。
　　 2.S1P通過增強維甲酸受體的配體依賴性降解作用，進而抑制維甲酸類藥物促進靶基因的轉(zhuǎn)錄，致腫瘤細胞對維