鞘脂代謝物對(duì)維甲酸類藥物腫瘤抑制過(guò)程中的影響.pdf

1、研究背景:
　　 鞘脂是真核細(xì)胞膜的主要成分，能代謝產(chǎn)生多種重要的信號(hào)分子。在鞘脂代謝物中，神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘氨醇磷酸(S1P)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Cer具有腫瘤抑制作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而S1P則被認(rèn)為具有促癌作用。細(xì)胞內(nèi)Cer和S1P的動(dòng)態(tài)平衡往往決定著細(xì)胞是處于增殖還是凋亡狀態(tài)。
　　 維甲酸類藥物是維生素A的結(jié)構(gòu)及功能類似物的總稱，這類物質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用

2、。維甲酸類藥物的作用主要由核內(nèi)受體維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)介導(dǎo)，通過(guò)激活RAR/RXR二聚體促進(jìn)含有RXRs或RARs識(shí)別元件的靶基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。維甲酸受體的表達(dá)缺失是癌癥發(fā)生過(guò)程中的常發(fā)與重要事件，這可能導(dǎo)致腫瘤對(duì)維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性。除了促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄外，維甲酸受體RXRα還可能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮重要作用，其中RXRα與孤兒受體TR3以二聚體形式進(jìn)入胞質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡，這被認(rèn)為是非常重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑之一。

3、r>　　 本課題主要進(jìn)行以下方面的研究:(1)Cer是否通過(guò)RXRα出核機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡？(2)S1P對(duì)維甲酸類藥物腫瘤抑制作用的影響及產(chǎn)生機(jī)制。
　　 該項(xiàng)研究的對(duì)于深入了解鞘脂類代謝產(chǎn)物影響維甲酸受體胞內(nèi)定位，功能改變和信號(hào)通路的異常傳導(dǎo)十分重要，同時(shí)其發(fā)現(xiàn)的S1P介導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生對(duì)維甲酸類藥物產(chǎn)生耐藥性、發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)和設(shè)計(jì)維甲酸衍生物具有指導(dǎo)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.Cer促進(jìn)RXRα出核的意義

4、>　　 以免疫熒光染色法檢測(cè)人肝癌SMMC-7721和肺癌H460細(xì)胞內(nèi)源性RXRα在Cer作用下的胞內(nèi)定位變化，以Westernblotting法確認(rèn)細(xì)胞中Cer促使RXRα出核現(xiàn)象。以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法檢測(cè)外源性表達(dá)的GFP-RXRα在Cer作用下能否由核內(nèi)遷移進(jìn)入胞質(zhì)。以熒光素酶報(bào)告基因法分析293A細(xì)胞中Cer能否拮抗9-cis-RA促進(jìn)RAR/RXR對(duì)含有維甲酸識(shí)別元件(RARE)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水平。以MTT法分析Cer抑制SMMC

5、-7721與SMMC-7721/RXRα細(xì)胞生長(zhǎng)程度的差異。以Westernblotting法檢測(cè)SMMC-7721和H460細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)的RXRα表達(dá)量及cleavedPARP表達(dá)變化。
　　 2.S1P引起腫瘤細(xì)胞對(duì)維甲酸類藥物耐藥的機(jī)制研究
　　 以MTT法檢測(cè)不同濃度S1P對(duì)SMMC-7721和PLC/PRF/5細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)S1P能否解除全反式維甲酸(ATRA)所致的細(xì)胞G1期阻滯作用。以

6、Westernblotting法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)S1P對(duì)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞RARβ表達(dá)的影響，以熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法分析S1P能否拮抗ATRA對(duì)含有RARE的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用。
　　 以免疫熒光染色和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法分析細(xì)胞中RXRα和鞘氨醇激酶2(Sphk2)定位的一致性，以免疫共沉淀法檢測(cè)Sphk2和RXRα能否結(jié)合。在HT-29細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HA-Sphk2和空載體，以Westernblotting法和半定量RT-P

7、CR法檢測(cè)外源表達(dá)的Sphk2能否抑制ATRA和RXR激動(dòng)劑LGD1069促進(jìn)RARβ轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的作用，在293A和HT-29細(xì)胞中，以熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法分析Sphk2能否抑制ATRA和9-cis-RA對(duì)含有RARE的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用。
　　 以半定量RT-PCR法檢測(cè)蛋白酶體抑制劑MG132能否解除S1P抑制ATRA促進(jìn)RARβ轉(zhuǎn)錄的作用。以Westernblotting法檢測(cè)RXRα在LGD1069和ATRA存在時(shí)

8、的蛋白降解能否被S1P增強(qiáng)，以及S1P促進(jìn)對(duì)RARβ在ATRA存在時(shí)的修飾和降解。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.Cer能夠促進(jìn)RXRα由細(xì)胞核遷移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)
　　 在含有0.5％血清的培養(yǎng)基中，以10μM的Cer處理12小時(shí)后，H460和SMMC-7721細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡特征，同時(shí)RXRα出核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。Westernblotting實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了Cer引起SMMC-7721細(xì)胞的RXRα出核現(xiàn)象。在SMMC-772

9、1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-RXRα，Cer處理10h后，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)RXRα已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。
　　 2.Cer引起細(xì)胞凋亡的作用并不依賴于RXRα出核誘導(dǎo)凋亡這一途徑
　　 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明，Cer不影響9-cis-RA促進(jìn)RXR/RAR對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在建立的SMMC-7721/RXRα穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中RXRα表達(dá)量明顯增高，而MTT結(jié)果顯示Cer對(duì)SMMC-7721/RXRα和SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制

10、作用差異并不顯著。在Cer誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，3h時(shí)cleavedPARP明顯增多，至12h達(dá)高峰;而RXRα表達(dá)量在9h下降，第12h下降14.2％，這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)正是RXRα出核最明顯之處。Cer所致的RXRα降解在H460細(xì)胞中尤為明顯。
　　 3.S1P拮抗ATRA和LGD1069抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用
　　 MTT結(jié)果顯示:與10μMATRA單獨(dú)作用比較，合用0.01或0.1μMS1P后，HT-29

11、細(xì)胞增殖水平分別增加了15.1％和26.2％，H460細(xì)胞增殖增加了14.0％和15.2％。與10μMLGD1069單獨(dú)作用相比，合用1μM的S1P時(shí)，A549細(xì)胞數(shù)增加33.5％，而HCT116細(xì)胞增加29.8％。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ATRA(5μM)能夠引起HT-29細(xì)胞G1期阻滯，合用S1P(0.1μM)，則能解除ATRA引起的細(xì)胞G1阻滯。
　　 4.S1P拮抗ATRA誘導(dǎo)RARβ表達(dá)作用
　　 Westernblo

12、tting結(jié)果顯示:ATRA(1μM)能使HT-29和SMMC-7721細(xì)胞RARβ表達(dá)量明顯增加，S1P則能抑制ATRA對(duì)RARβ表達(dá)的誘導(dǎo)作用。Real-timePCR結(jié)果顯示:S1P的上述拮抗作用具有時(shí)間依賴性。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn):S1P濃度為0.001，0.01和0.1μM時(shí)，RARE轉(zhuǎn)錄活性與ATRA單獨(dú)作用相比分別下降7.8，19.4和37.3％。
　　 5.Sphk2與RXRα能結(jié)合并抑制ATRA和LGD10

13、69對(duì)RXR/RAR的激活
　　 與內(nèi)源性表達(dá)的Sphk2和RXRα相同，在HT-29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染的HA-Sphk2和GFP-RXRα均位于核內(nèi)，而在TPA刺激下均進(jìn)入胞質(zhì)中。以免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sphk2與RXRα能夠結(jié)合，而Sphk1則不能與之結(jié)合。RT-PCR和Westernblotting結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染了Sphk2的細(xì)胞，ATRA和LGD1069誘導(dǎo)RARβ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平明顯減少。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明:隨著Sphk2

14、劑量增加，ATRA和9-cis-RA促進(jìn)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的作用隨之下降。
　　 6.S1P拮抗ATRA誘導(dǎo)RARβ表達(dá)作用與蛋白酶體降解途徑有關(guān)
　　 以半定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ATRA單獨(dú)作用相比，S1P和ATRA聯(lián)合作用時(shí)HT-29細(xì)胞RARβ的mRNA表達(dá)量下降了41.8％;而當(dāng)ATRA，S1P和MG132聯(lián)合作用時(shí)，僅比ATRA單獨(dú)作用降低了7.7％。
　　 7.S1P促進(jìn)維甲酸受體配體依賴性降解

15、>　　 Westernblotting結(jié)果證明:LGD1069單獨(dú)作用時(shí)RXRα產(chǎn)生了配體依賴性降解，當(dāng)S1P與LGD1069聯(lián)合作用時(shí)，RXRα表達(dá)量進(jìn)一步下降47.3％。ATRA能夠誘導(dǎo)RXRα的降解作用，但ATRA與S1P合用時(shí)RXRα的量比ATRA單獨(dú)作用時(shí)反而增加了91.7％，說(shuō)明RARβ表達(dá)水平的降低可能導(dǎo)致RXRα不能被ATRA誘導(dǎo)降解。當(dāng)ATRA和MG132合用時(shí)，在RARβ上方出現(xiàn)了新條帶，合用S1P后條帶加深。用抗

16、乙?；嚢彼峥贵w檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ATRA和MG132合用時(shí)也出現(xiàn)了一條新條帶，當(dāng)ATRA,MG132和S1P聯(lián)合作用時(shí)條帶也加深，初步推測(cè)是RARβ發(fā)生了乙?；揎?。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 1.由Cer引起的RXRα出核現(xiàn)象可能并不直接引起凋亡作用，其出核的直接作用可能與Cer誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)蛋白的降解作用有關(guān)。
　　 2.S1P通過(guò)增強(qiáng)維甲酸受體的配體依賴性降解作用，進(jìn)而抑制維甲酸類藥物促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，致腫瘤細(xì)胞對(duì)維