鞘氨醇激酶2對全反式維甲酸腫瘤抑制活性的影響.pdf

1、研究背景:
　　在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中，鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，Sphk)及其代謝產物鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)的作用備受關注。作為一種脂類激酶，SphK在細胞遷徙、增殖、凋亡等過程中具有重要的調控作用。機體內的重要脂質鞘氨醇可通過Sphk的催化而轉變?yōu)榫哂写偕L作用的因子S1P，也可通過神經酰胺合成酶的作用轉變成誘導凋亡作用的因子神經酰胺（ceramide

2、，Cer）。S1P/Cer的平衡能夠決定細胞生存還是凋亡，而Sphk是調節(jié)這一平衡的關鍵酶，因此Sphk是細胞存亡的重要調節(jié)者。
　　維甲酸類藥物是維生素A的結構及功能類似物的總稱，這類物質對于調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡具有重要作用。維甲酸類藥物的作用主要由核內受體維甲酸受體(RAR)和維甲類X受體(RXR)介導，通過激活RAR/RXR二聚體促進含有RXRs或RARs識別元件的靶基因轉錄而實現。維甲酸受體的表達缺失是癌癥發(fā)生過程中

3、的常發(fā)與重要事件，可能導致腫瘤對維甲酸類藥物產生耐藥性。
　　本課題旨在將細胞對維甲酸的敏感性高低同鞘氨醇激酶聯系起來，探討SphK2的下調能否提高腫瘤細胞對全反式維甲酸的敏感性以及其相關作用機制。該項研究的對于深入了解鞘臘類代謝產物S1P介導腫瘤產生對維甲酸類藥物產生耐藥性、發(fā)現新靶點和設計維甲酸衍生物具有指導意義。
　　實驗方法:
　　以小RNA干擾技術(SiRNA)抑制SphK2表達從而降低SphK2和S1P水平

4、，以克隆形成法檢測加入S1P以及干擾SphK2對HT-29細胞生長的影響，并檢測ATRA對野生型HT-29以及SiSphK2處理HT-29細胞的生長抑制能力。以流式細胞儀檢測S1P升高和降低分別對ATRA所致的細胞G1期阻滯和細胞凋亡作用的影響。以Western blotting法和實時定量PCR法檢測S1P對ATRA誘導細胞RARβ表達的影響以及相關周期、凋亡和PI3K/AKT等細胞通路的影響。
　　實驗結果:
　　Wes

5、tern blotting以及real-time PCR結果表明SiRNA能特異性降低SphK2水平約80％，且在96h內能夠保持在對照組的20-30％。0.1μM的S1P能夠拮抗10μM ATRA引起的HT-29細胞增殖抑制、受體RARβ的表達、細胞G1期阻滯和細胞凋亡;相反，SphK2干擾降低細胞SphK2水平和S1P水平，從而增強ATRA引起的細胞增值抑制、受體RARβ的表達、細胞G1期阻滯和細胞凋亡。Western blotti