肺癌遺傳易感性理論與方法學研究.pdf

1、華中科技大學同濟醫(yī)學院博士研究生學位論文肺癌連傳易感性理論與方法學研究博士研究生:指導老師:吳曉明周宜開摘要廠肺癌是嚴重威脅人類健康的一類疾病，越來越多的研究表明肺癌的發(fā)生存在遺傳易感因素.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種墓因的多態(tài)性與肺癌發(fā)生有關，如1相代謝酶基因細胞色素P40511相代謝酶基因谷就甘膚轉移酶、DNA損傷修復酶基因等。基因多態(tài)性的表現(xiàn)形式多種多樣，但單個核普酸的替代，即單核普酸多態(tài)性為目前研究的熱點。經(jīng)典的基于凝膠的基因多態(tài)性檢測方法由于

2、操作復雜、準確性差、接觸有毒有害物質而且不能自動化而逐漸淘汰基于熒光和芯片的技術由于其操作簡單、易于自動化而且是高通量檢測代表未來發(fā)展的方向，但其需要昂貴的設備和特定的技術防礙了目前在國內(nèi)的廣泛使用。因此建立一種快速、準確、價廉而且具有高通量前景的方法十分必要。鑒于此)我們建立了一種基于錯配雜交，采用酶聯(lián)免疫或化學發(fā)光進行檢測的基因突變鑒定方法。針對每個多態(tài)位點設計兩根寡核普酸探針，兩根探針的區(qū)別僅在于突變位點處一個堿基，即分別與野生型

3、和突變型DNA片段完全匹配。每個樣品分別與兩根探針進行雜交，以酶聯(lián)免疫或化學發(fā)光法檢測雜交產(chǎn)物。在合適的雜交條件下，完全匹配與不完全匹配的雜交產(chǎn)物穩(wěn)定性不同，利用二者的雜交信號強度之比確定基因型。我們將此方法應用于細胞色素P4501A1基因兩個多態(tài)位點的檢測，證實了其實際應用的可行性.乙DNA損傷修復是維持人體墓因組穩(wěn)定，防止癌癥發(fā)生的重要機制，包括核普酸切除修復(NER)、錯配修復、雙鏈斷裂修復、堿基切除修復等4個主要途徑。其中NER

4、機制因為可以修復多種致癌物質引起的DNA加合物而在DNA損傷修復中發(fā)揮關鍵作用。已有流行病學研究表明肺癌患者NER基因表達較對照人群明顯降低，因此我們想證實NER‘因表達水平是否可以作為肺癌易感性的生物標司苯并(a‘是一種已知的環(huán)境致癌物質，是肺癌發(fā)生的直接原因，其造成的DNA損傷主要通過NER途徑修復。我們采用一肺腺癌細胞株作為研究對象，以不同濃度的苯并(a)花處理細胞。結果表明低劑量苯并(a)花(IAM)可以誘導細胞NER基因表達上

5、升，細胞DNA損傷程度較輕高劑量苯并(a花(10pm)抑制細胞NER基因表達，細胞DNA損傷嚴重。因此，NER墓因表達水平可以評價DNA修奧能力，作為肺癌易感性的檢測指標。——一t摘要華中科技大學同濟醫(yī)學院博士研究生學位論文%4.0%和9.5%日間變異分別為5.0%8.7%和12.9%m位點，三種基因型日內(nèi)變異為7.0%5.1%和11.2%日間變異為11.0%8.9%和14.3。為證實此方法應用于大量樣品時的可行性，我們隨機檢測了50個

6、樣品。m:位點中，22個野生型樣品平均比值為2.04(SD=O.12CV=6.0%)20個雜合型樣品平均比值為0.78(SD=0.072CV=9.2%)8個突變型樣品平均比值為0.33(SD=0.045CV=13.8%)m位點中，24個野生型樣品平均比值為4.36(SD=0.50CV=11.50%)21個雜合型樣品平均比值為0.63(SD=0.064CV=10.10%)5個突變型樣品平均比值為0.060(SD=0.0093CV=15.6

7、%0)。三種基因型樣品的比值分別位于三個互不重疊的區(qū)域內(nèi)，證實了該方法在實際應用中的可行性.另外，我們對采用的辣根過氧化物酶ABTS檢測體系進行了評價，并對實驗條件進行了優(yōu)化。該系統(tǒng)具有良好的線性關系和重復性(r=0.999CV=3.2%)以顯色時問不超過30min衡量，檢測限為6.25ng25mUml人ntiDigPOD可以滿足實驗要求而且ABTS顯色時間對比值影響很小，因此不同量的PCR產(chǎn)物可以同時進行分析?；瘜W發(fā)光法檢測:首先，我

8、們對辣根過氧化物酶一魯米諾一過氧化氫一對碘苯酚化學發(fā)光體系進行了優(yōu)化。發(fā)光動力學實驗表明發(fā)光反應啟動2分鐘后，發(fā)光強度進入平臺期4Ngml鏈酶親合素包被的發(fā)光管檢測效果最好1:10。稀釋的發(fā)光底物具有最佳的相關性和重復性。我們選擇水為雜交緩沖體系，以降低雜交溫度，簡化后續(xù)操作過程。。:位點中，野生型樣品與完全匹配及不完全匹配檢測探針的TM值分別為380C和300C突變型樣品與兩種探針的TM值分別為420C和290Cm位點中，單個堿基錯配

9、使野生基因型樣品TM值從350C降至280C使突變基因型樣品TM值從380C降至270C.根據(jù)理論解鏈曲線，分別于360C380C400C進行雜交反應。一次加入檢測探針和AntiDigPOD，使吸附、雜交、酶聯(lián)在發(fā)光管中同時進行，洗滌后加入發(fā)光底物進行檢測，確定400C為適宜雜交溫度。同酶聯(lián)免疫法，我們分析了方法的日內(nèi)及日間變異，檢測敏感性，并對8。個樣品進行了檢測。結果表明m，和m位點的檢測限分別為2.5和。5ng80個樣品的比值位于

10、三個互不重疊的區(qū)域內(nèi)，可以嚴格區(qū)分。2笨并(a)花對沛建細造DNA報傷友修復森因表達水平的形響采用1NM和lopm苯并(a)花處理肺癌A549細胞，分別于處理1224小時和處理后1224和48小時提取細胞總RNA和總蛋白。RTPCR技術檢測NER途徑8個基因(XPAXPBXPCXPDXPFXPGCSBERCCl)mRNA表達水平，結果表明1FM苯并(a)花處理誘導所有8個NER基因表達上調(diào)，而lopm苯并(a)花處理下調(diào)8個NER墓因表