I子癇前期胎盤syncytin-1甲基化狀態(tài)的研究IISyncytin-1在非小細胞肺癌的初步研究.pdf

1、研究背景
　　 子癇前期（preeclampsia,PE）是人類妊娠期常見的一種多系統(tǒng)疾病，發(fā)生率約2％～8％，嚴重威脅著母嬰健康，是導致孕產(chǎn)婦和胎兒圍產(chǎn)期死亡的主要產(chǎn)科并發(fā)癥。臨床特征為妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓（BP≥140/90mmHg）及蛋白尿（尿蛋白≥0.3g/24h或隨機尿蛋白陽性）。幾十年來，婦產(chǎn)界許多研究者長期致力于該病的研究，但至今子癇前期的病因和發(fā)病機制尚未闡明。除終止妊娠之外缺乏有效的臨床治療方法，始終是引起

2、孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一。因此，該病一直是產(chǎn)科領域研究的熱點。臨床發(fā)現(xiàn)子癇前期在胎盤娩出后臨床癥狀逐漸消失，因此胎盤成為子癇前期發(fā)病的關鍵，胎盤學研究成為子癇前期病因?qū)W研究焦點。滋養(yǎng)細胞(cytotrophoblast，CT)是胎盤組織中主要的細胞類型，與母體接觸最為緊密，它的分化、遷移、侵入異常直接導致胎盤形成缺陷，與子癇前期的發(fā)病密切相關。子癇前期胎盤病理特點之一為合體滋養(yǎng)細胞(syncytiotrophoblast，ST)層發(fā)育不

3、良。Sha等首次于2000年報道，人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄缺陷病毒(humanendogeneousretrovirus，HERV)家族一員HERV-W的包膜蛋白syncytin在胎盤組織高度表達。Syncytin的功能有介導體內(nèi)胎盤滋養(yǎng)細胞的生長分化，促進細胞融合，抗凋亡和免疫抑制等。Syncytin-1是一個功能性融合蛋白可以介導滋養(yǎng)細胞融合成合體滋養(yǎng)細胞，這種多核的合體滋養(yǎng)細胞層是營養(yǎng)交換的場所，還可以分泌人絨毛膜促性腺激素(humanch

4、orionicgonadotrophin，HCG)和人絨毛膜促乳素(humanchorionicsomatomammotropin，HCS)，對于維持正常的胎盤功能非常重要。Syncytin表達減少會導致細胞滋養(yǎng)細胞融合與分化異常，合體滋養(yǎng)細胞形成減少，血管功能紊亂和絨毛缺氧，可能是子癇前期的病因之一。
　　 除了傳統(tǒng)的研究，人們逐漸認識并越來越重視表觀遺傳學在PE發(fā)病中的作用。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在DNA

5、甲基轉(zhuǎn)移酶DNAmethyltransferases，DNMTs）的作用下，將CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化為5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的一種化學反應。DNA甲基化的作用包括調(diào)控基因表達、基因印記、維持基因組和染色體結構的穩(wěn)定性等。Syncytin甲基化在子癇前期胎盤的狀態(tài)國內(nèi)外報道較少，DNMT3L與syncytin甲基化的關系國內(nèi)外未見報道。本研究采用實時定量PCR，免疫組化，Westernblot方法檢測子癇前期胎盤組織sy

6、ncytin-1mRNA及蛋白表達，甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)，結合亞硫酸氫鹽限制分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)，測序技術檢測syncytin-1啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。探討syncytin-1在子癇前期中的發(fā)病機制以及其甲基化與基因表達的關系，為PE的診斷病情監(jiān)測治療提供依據(jù)。
　　 第一部分子癇前期胎盤syncytin

7、-1甲基化狀態(tài)
　　 目的:
　　 分析子癇前期胎盤組織中syncytin-1的表達情況，syncytin-1甲基化狀態(tài)及其與基因表達的關系，探討子癇前期的發(fā)病機制。
　　 方法:
　　 1.實時定量PCR法檢測syncytin-1，ASCT2，HCS，GCMa，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNMT3a)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNMT3b)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3L(DNMT3L

8、)在正常第三期(3N)和子癇前期(3P)胎盤組織mRNA水平;
　　 2.免疫組化法檢測syncytin-1，HCS，DNMT1，DNMT3b，DNMT3L,5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytidine，5mC）在子癇前期和正常胎盤組織蛋白定位表達情況;Westernblot法檢測syncytin-1在子癇前期和正常胎盤組織蛋白表達情況;
　　 3.采用甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR

9、，MSP)，結合亞硫酸氫鹽限制分析法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)和重亞硫酸氫鹽測序方法，檢測子癇前期胎盤和正常胎盤組織syncytin-1啟動子區(qū)5'-LTRs甲基化狀態(tài)。
　　 結果:
　　 1.以GAPDH為內(nèi)參照基因，與正常第三孕期(3N)相比，子癇前期(3P)胎盤組織中DNMT3a，DNMT3b，syncytin-1和HCSmRNA表達水平降低(P＜0.

10、05)，DNMT1，DNMT3LmRNA表達水平升高(P＜0.05);GCMa，ASCT2兩組比較無顯著性差異(P＞0.05);PCNA為內(nèi)參照基因，與3N相比，3P胎盤組織中DNMT1，DNMT3b，DNMT3LmRNA表達水平升高，DNMT3amRNA表達水平降低(P＜0.05)。
　　 2.與3N相比，3P胎盤組織中syncytin-1和HCS蛋白表達較弱，DNMT3b，DNMT3L蛋白表達較強，而DNMT1，5mC染色結

11、果兩組無顯著差異;Westernblot分析顯示，syncytin-1在3N胎盤組織中強表達，在3P胎盤中弱表達;
　　 3.MSP，COBRA和測序結果均顯示，與3N相比，3P胎盤組織中syncytin-1啟動子區(qū)5'-LTRs甲基化水平升高(P＜0.05);
　　 4.Spearman相關性分析，syncytin-1與DNMT3bmRNA水平負相關(r=-0.544，P＜0.05);Syncytin-1與HCSmRN

12、A水平正相關(r=0.713，P＜0.01);Syncytin-1mRNA水平與其甲基化水平呈負相關（r=-0.505，P＜0.05）;DNMT3b與syncytin-1甲基化水平呈正相關(r=0.451，P＜0.05);DNMT3L與syncytin-1甲基化水平呈正相關(r=0.536，P＜0.05);DNMT3b與DNMT3LmRNA水平正相關（r=0.554，P＜0.05）;三種常用的甲基化檢測方法中，MSP和COBRA(r=0

13、.443，P＜0.05)，COBRA和測序（r=0.862，P＜0.01）結果呈正相關。
　　 結論:
　　 1Syncytin-1表達降低與子癇前期發(fā)病密切相關，但其受體ASCT2與子癇前期發(fā)病無關;
　　 2.在子癇前期syncytin-1異常升高的甲基化模式參與了子癇前期的發(fā)病，機制可能是syncytin-1啟動子區(qū)高甲基化抑制了其基因的表達;
　　 3.DNMTs參與了syncytin-1甲基化的