逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)人白介素-2基因轉(zhuǎn)染肝干細胞的實驗研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)人白介素2基因轉(zhuǎn)染肝干細胞的實驗研究姓名：鄭和鳴申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（普外科）指導(dǎo)教師：蔡秀軍20070501浙江人學(xué)博學(xué)位論文中文文摘動物實驗打下基礎(chǔ)。第一部分人白細胞介素2cDNA的克隆及原核載體的構(gòu)建及其表達目的：通過RTPCR從人體周圍靜脈血中擴增IL一2全長編碼序列，并構(gòu)建重組原核表達載體PET一32a—IL一2，并在大腸桿菌BL21中表達。方法：分離健康人外周靜脈血單核巨噬細胞，通

2、過細胞總RNA的提取、盯一PCR從人體周圍靜脈血中擴增IL一2全長編碼序列，并將其克隆至T載體中。測序，并利用DNAStar軟件對所測定的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進行編輯、分析。將IL一2全長編碼序列克隆至PET一32aIL一2原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，并經(jīng)10％SDS—PAGE凝膠屯泳、考馬斯亮藍染色及Westenblot鑒定。結(jié)果：正確擴增出人IL2全長編碼序列，測序結(jié)果正確，并分析了人白介素一2的

3、蛋白結(jié)構(gòu)。正確構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒PET32aIL2，測序結(jié)果正確，并在大腸桿菌中高效表達。結(jié)論：擴增出的人IL一2和文獻報道的cDNA序列一致，并構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒PET32a—IL一2。關(guān)鍵詞：人白介素一2，克隆，序列分析，原核表達載體，基因表達第二部分攜帶人IL屯基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其在PT67細胞中的包裝目的：構(gòu)建人白介素一2基岡的逆轉(zhuǎn)錄病毒體系Plpcx—E6FP、Plpcx—IL一2EGFP及Plpcx—IL一

4、2，并研究其在包裝細胞PT67中的表達。方法：采用DNA重組技術(shù)，將pEGFPNI質(zhì)粒用占coRl和NotI進行雙酶切，獲得EGFPcDNA片段，與用同樣酶切的Plpcx載體在LigationMix連接酶的作用下進行連接反應(yīng)，構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體PlpexEGFP。酶切鑒定，測序證實。以P町一32aIL一2為模板，通過PCR擴增IL2金長編碼序列，刪和EcoRI_)嘆酶切后將該片段克隆至Plpcx—EGFP。構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒