逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)白細胞介素27轉(zhuǎn)染人食管癌細胞抗腫瘤效應(yīng)及其機理研究.pdf

1、本研究主要目的是深入探討IL-27在人食管癌中的抗腫瘤作用及其機理,為食管癌的基因治療研究提供實驗和理論依據(jù)。 第一部分表達重組IL-27基因的人食管癌細胞Eea109/IL-27的建立 目的:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體將重組小鼠IL-27基因轉(zhuǎn)染人食管癌細胞(Eca109),建立能表達和分泌IL-27的腫瘤細胞(Eca109/IL-27),并檢測外源性IL-27基因轉(zhuǎn)染對Eea109細胞體外增殖及其生物學(xué)性狀的影響,為深入

2、研究IL-27在食管癌中的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。 方法:將攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(LXSN/IL-27),經(jīng)過ψ2和PA317包裝細胞兩次包裝,利用該逆轉(zhuǎn)錄病毒將IL-27基因?qū)肴耸彻馨〦ta109細胞,經(jīng)G418篩選后獲得表達IL-27的陽性細胞克隆Eca109/IL-27.用RT-PCR檢測目的基因的表達；ELISA法檢測IL-27的分泌；免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡檢測IL-27蛋白的表達；MTT比色法檢測腫

3、瘤細胞的體外增殖；流式細胞儀分析Eca109/IL-27細胞表面HLA-A,B,C(MHCI類分子)、HLA-DR(MHCII類分子)和CD80、CD86的表達。 結(jié)果: 1.攜帶IL-27基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒滴度為4～6×105CFU/ml,其培養(yǎng)上清中IL-27的分泌量為157.24±5.9 pg/ml,可用于轉(zhuǎn)染腫瘤細胞。 2.建立了能分泌IL-27的人食管癌Eea109/IL-27細胞,經(jīng)RT-PCR以

4、及激光共聚焦顯微鏡和ELISA證實在mRNA水平和蛋白水平IL-27均可穩(wěn)定表達(P<0.01),IL-27的分泌量為153.73±7.00pg/ml.表明外源IL-27基因已整合到Eca109/IL-27細胞的基因組中并高效表達。 3.Eca109/IL-27細胞的形態(tài)特征及增殖反應(yīng)與野生型Eca109細胞和Eta109/LXSN細胞均無明顯差別(P>0.05)。 4.Eta109/IL-27細胞的細胞表面分子HLA-

5、A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達水平與野生型Eta109細胞和Eta109/LXSN細胞無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論:成功建立表達IL-27基因的人食管癌細胞(Eca109/IL-27)；IL-27基因?qū)隕ca109細胞后,對細胞的形態(tài)和增殖及細胞表面分子的表達均無顯著影響。 第二部分IL-27對免疫細胞功能影響的體外研究 目的:研究IL-27對人外周血淋巴細胞和裸鼠脾淋巴細胞免疫功能

6、的影響。 方法:將Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eta109細胞培養(yǎng)上清作用于人外周血淋巴細胞,用ELISA法檢測誘導(dǎo)IL-12p70、IFN-γ、TNF-α和IL-4的產(chǎn)生情況,流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T細胞的含量和細胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達,乳酸脫氫酶(LDH)法檢測殺傷性T細胞(CTL)活性；將上述細胞培養(yǎng)上清作用于裸鼠脾細胞,ELISA法檢測IFN-

7、γ的產(chǎn)生,LDH法檢測殺傷活性。 結(jié)果: 1.IL-27對人外周血淋巴細胞免疫功能的影響 Eca109/IL-27細胞培養(yǎng)上清可誘導(dǎo)人外周血淋巴細胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ、TNF-α僅和IL-12p70等Th1類細胞因子,與Eca109/LXSN和Ecal09細胞相比有非常顯著性差異(P<0.01),而Th2類細胞因子IL-4的分泌水平三組間無明顯差異(P>0.05)；外周血淋巴細胞經(jīng)Eca109/IL-27細胞

8、的培養(yǎng)上清誘導(dǎo)后CD4+、CD8+T細胞百分比顯著增高(P<0.01),CTL對腫瘤細胞的殺傷活性顯著增強(P<0.01),細胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表達水平提高(P<0.01)。 2.IL-27對裸鼠脾細胞免疫功能的影響 Eca109/IL-27細胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)裸鼠脾細胞產(chǎn)生IFN-γ為48.7±4.3pg/ml,高于Eca109/LXSN和Eca109組(分別為6.3±1.5

9、pg/ml和4.9±1.4 pg/ml)(P<0.01),對腫瘤細胞的殺傷活性顯著增強(P<0.01)。 結(jié)論:IL-27能夠增強淋巴細胞免疫功能和對腫瘤細胞的殺傷活性。 第三部分 IL-27在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)及作用機理研究 實驗一 IL-27對荷瘤裸鼠腫瘤生長及免疫調(diào)節(jié)作用研究 方法:將Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109細胞分別皮下和腹腔接種于裸鼠體內(nèi),觀察成瘤性、腫瘤生

10、長情況及荷瘤裸鼠生存期.免疫組化法檢測裸鼠移植瘤組織NK細胞浸潤；ELISA法檢測脾細胞IFN-γ產(chǎn)生:LDH法檢測脾細胞的殺傷活性；RT-PCR檢測移植瘤組織中IL-27基因和其他細胞因子基因的表達。 結(jié)果: 1.接種Eca109/IL-27細胞與Eca109/LXSN和Eca109細胞后,裸鼠成瘤率均為100％.接種Eca109/IL-27細胞裸鼠腫瘤生長速度明顯慢于接種Eca109/LXSN和Eca109細胞組(P

11、<0.05),裸鼠生存期延長(P<0.01)。 2.接種Eca109/IL-27細胞組腫瘤組織中有IL-27p28和IL-27EB13基因的表達,而接種Eca109/LXSN和Eca109細胞組腫瘤組織中未檢測到IL-27p28和IL-27EBI3基因的表達。 3.接種Eca109/1L-27細胞組腫瘤組織中NK細胞浸潤比率較接種Eca109/LXSN和Eca109細胞組顯著增高(P<0.01)。 4.接種Eca

12、109/IL-27細胞組裸鼠脾細胞IFN-γ的產(chǎn)生增加(P<0.01)；IFN-γ的產(chǎn)生與用滅活的野生型Eca109細胞再次誘導(dǎo)與否無關(guān)(P>0.05)。 5.接種Eca109/IL-27細胞的裸鼠脾細胞對腫瘤細胞的殺傷活性顯著增強(P<0.01)。 6.接種Eca109/IL-27細胞組T-bet、IL-12Rβ2、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達較接種Eca109/LXSN和Ecal09細胞組增高(P<

13、0.05)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染IL-27的Eca109細胞在裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生了明顯的抗腫瘤作用.IL-27促進荷瘤鼠移植瘤組織間質(zhì)中NK細胞的浸潤；提高了脾細胞產(chǎn)生IFN-γ的能力和殺傷活性；IL-27可促進荷瘤鼠移植瘤組織中細胞因子的表達。 實驗二IL-27誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用研究 方法:采用流式細胞儀分析體外培養(yǎng)的腫瘤細胞及體內(nèi)腫瘤組織的細胞凋亡率；TUNEL法檢測三組腫瘤組織細胞原位凋亡；電鏡觀察腫瘤組織細胞凋亡的超

14、微結(jié)構(gòu)變化；用RT-PCR和Westem-blot法檢測腫瘤組織凋亡相關(guān)基因Fas和Survivin的表達。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng)的Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109細胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)；然而,將這三種腫瘤細胞接種于裸鼠后觀察,接種Eca109/IL-27細胞組裸鼠腫瘤細胞凋亡率較接種野生型Eca109細胞組和Eca109/LXSN細胞組顯著增高。 2.TUNEL法檢

15、測結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細胞組腫瘤組織內(nèi)有灶性分布的凋亡細胞,細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒,接種Eca109/LXSN細胞組和Eca109細胞組腫瘤組織內(nèi)僅見極少數(shù)散在分布的凋亡細胞.接種Eca109/IL-27組細胞凋亡率明顯高于接種Eca109/LXSN細胞組和野生型Eca109細胞組。 3.電鏡觀察可見,接種Eca109/IL-27細胞組腫瘤組織細胞呈典型的凋亡細胞形態(tài),而接種Eca109和Eca109/LXSN細

16、胞組腫瘤組織細胞呈典型的腫瘤細胞形態(tài),未發(fā)現(xiàn)凋亡征象。 4.RT-PCR結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細胞組裸鼠腫瘤組織中FasmRNA表達水平顯著高于接種Eca109/LXSN細胞和野生型Eca109細胞組(P<0.01)；而Survivin mRNA在接種Eca109/IL-27細胞組裸鼠瘤組織中的表達水平則顯著低于接種Eca109/LXSN細胞和Ecal09細胞組(P<0.01),轉(zhuǎn)染IL-27組Survivin與

17、Fas的比值降低(P<0.01)。 5.Western-blot結(jié)果顯示,接種Eca109/IL-27細胞組裸鼠腫瘤組織中Fas蛋白表達水平明顯高于接種Eca109/LXSN細胞和野生型Ecal09細胞組(P<0.01)；而Survivin蛋白在接種Eca109HL-27細胞組裸鼠腫瘤組織中的表達水平則明顯低于接種Eca109/LXSN細胞和Eca109細胞組(P<0.01),轉(zhuǎn)染IL-27組Survivin與Fas比值降低(P