吡格列酮通過抑制髓過氧化物酶保護高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能.pdf

1、研究背景: 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是當今嚴重威脅人類生命的首敵，目前已成為影響國人壽命和老年人生存質(zhì)量的重要疾病之一。高脂血癥引起的血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化形成的第一步，其主要機制包括一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達或活性的改變、與NOS激活相關的輔因子表達的改變、一氧化氮(nitric oxide，NO)大量生成但其生物利用度卻大大降低等。其中，NO生物利用度降低，NO/cGMP/

2、cGK信號轉導通路受損被認為是最為重要的機制。 大量研究表明，過氧化物酶增殖體激活受體激動劑γ(Peroxisome proliferator-activatedreceptorγ，PPARγ)具有抗炎和改善血管內(nèi)皮功能等作用，但其確切機制還不清楚。由于MPO是炎癥反應主要因子之一，而且有研究報道，PPARγ激動劑在不同細胞可以調(diào)節(jié)MPO基因不同形式的表達。我們推測PPARγ激動劑是否通過調(diào)節(jié)MPO來改善高脂血癥時血管內(nèi)皮功能，

3、進而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生。 目的: 1、驗證我們以前的實驗結果。即，高脂血癥時，通過NO/cGMP/cGK信號通路受損導致血管內(nèi)皮功能障礙； 2、觀察分析MPO是否通過改變血管NO/cGMP/cGK信號通路介導高脂血癥內(nèi)皮功能障礙； 3、PPARγ激動劑吡格列酮(PIO)是否能夠逆轉高脂血癥所導致的血管內(nèi)皮功能障礙。如果可以，是否與調(diào)節(jié)血管MPO有關。 第一部分MPO介導高脂血癥誘導的大鼠血管內(nèi)

4、皮功能障礙1方法1.1動物及分組選用健康雄性Wistar大鼠32只，隨機分為以下五組： ①普通對照組(n=8)：僅喂普通飼料八周； ②高脂血癥組(n=8)：喂八周高脂飼料； ③高脂血癥+MPO抑制劑氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，最后6天同時用氨苯砜腹腔注射； ④高脂血癥+溶劑對照組(n=8)：喂八周高脂飼料，后6天同時用DMSO腹腔注射。 結果： 1、食源性大鼠高脂血癥動物模型的建立

5、高脂飲食8周后，高脂飲食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平顯著高于高脂飲食之前以及同期普通飲食大鼠血脂水平(表1，表2)。 2、高脂血癥致血管內(nèi)皮功能障礙與正常對照組相比，高脂血癥組大鼠胸主動脈環(huán)上10-9-10-5mol/LACh誘導血管舒張的logEC50顯著升高，即EC50值顯著降低(P<0.01，圖2a)；同時，血管最大舒張程度明顯降低(P<0.01，圖1a、圖1b、圖2b)。給予10-10-10-6mol/L累積

6、濃度的SNP(一種外源性NO的供體)后，兩組間的血管張力無明顯差別。 3、高脂血癥誘導的血管NO/cGMP/cGK信號轉導通路受損2.3.1高脂血癥大鼠血管的NO含量減少為了驗證與高脂血癥誘導的血管內(nèi)皮功能障礙相關的信號轉導途徑，我們測定了血管組織的NOx含量。與正常對照組相比，高脂血癥大鼠血管NOx含量明顯降低(P<0.01，圖4)。 4、高脂血癥大鼠血管MPO活性增高為了觀察高脂血癥時血管MPO的變化，我們檢測了血管

7、MPO活性。與正常對照組大鼠相比，高脂血癥使大鼠血管MPO活性顯著升高(P<0.01，圖6)。 5、血管內(nèi)皮功能與MPO活性呈負相關血管內(nèi)皮功能與MPO的活性進行相關性分析結果顯示，ACh誘導血管舒張的logEC50值與MPO活性呈正相關(r=0.797，P<0.01，圖7)，即ACh誘導血管舒張的EC50值與MPO活性呈負相關；ACh誘導的血管最大舒張程度與MPO活性呈負相關(r=-0.883，P<0.01，圖8)。

8、6、血管組織Nox和cGMP含量均與MPO活性呈負相關為了進一步證實MPO是否與高脂血癥誘導的血管NO/cGMP/cGK信號轉導途徑受損的相關，對血管組織NOx和cGMP含量與MPO的活性進行相關性分析。結果表明，血管組織NOx和cGMP含量均與MPO活性呈負相關，其r值分別為-0.768(P<0.01，圖9)和-0.955(P<0.01，圖10)。說明，高脂血癥時血管MPO活性升高與血管NO/cGMP/cGK信號轉導途徑受損及血管內(nèi)皮

9、功能障礙相關。 7、 MPo抑制劑-氨苯砜降低高脂血癥大鼠血管組織MPO活性為了進一步探討MPO在高脂血癥誘導的內(nèi)皮功能障礙中的作用，我們給予高脂血癥大鼠MPO的抑制劑-氨苯砜。用MPO抑制劑氨苯砜干預后，高脂血癥大鼠血管MPO活性明顯降低(P<0.01)，而溶劑DMSO對高脂血癥大鼠血管MPO活性無明顯影響(圖11)。 8、氨苯砜干預后，高脂血癥誘導的血管內(nèi)皮功能障礙減輕與高脂對照組相比，用氨苯砜干預后，ACh誘導的血

10、管舒張的logEC50明顯降低(P<0.01，圖12a)；同時，血管最大舒張程度明顯增高(P<0.01，圖12b、圖14a)。用DMSO干預后，ACh誘導的血管最大舒張程度增高(P<0.01，圖12b)，而兩組間logEC50值卻無明顯差異(圖12a)。ACh誘導的血管最大舒張程度在氨苯砜組和溶劑對照組間有明顯差異(P<0.01)。在給予10-10mol/L-10-6mol/L累積濃度的SNP后，血管張力在各組間無明顯差別(圖13、圖1

11、4b)。 9、氨苯砜干預后，改善高脂血癥誘導的血管NO/cGMP/cGK信號轉導通路損傷2.9.1氨苯砜干預后，高脂血癥大鼠血管NO含量升高為了探討與MPO介導的高脂血癥誘導的血管內(nèi)皮功能障礙的作用機制，我們測定了氨苯砜干預后血管組織的NOx含量。與高脂血癥組相比，用MPO抑制劑氨苯砜干預后，高脂血癥大鼠血管NOx含量明顯回升(P<0.01)，而溶劑DMSO干預組其血管NOx含量無明顯改變(圖15)。 以上結果提示，高脂

12、血癥時血管MPO活性增高，進而使血管NO/cGMP/cGK信號轉導通路受損，導致血管內(nèi)皮功能障礙。 第二部分吡格列酮通過抑制髓過氧化物酶改善高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能障礙1方法1.1動物及分組選用健康雄性Wistar大鼠32只，隨機分為以下五組： ①普通對照組(n=8)：僅喂普通飼料八周； ②高脂血癥組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時用色拉油(溶劑)灌胃； ③高脂血癥+吡格列酮組(n=8)：喂八周高脂

13、飼料，后四周同時用吡格列酮灌胃； ④高脂血癥+氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時用色拉油(溶劑)灌胃，最后6天同時用氨苯砜腹腔注射； ⑤高脂血癥+吡格列酮+氨苯砜組(n=8)：喂八周高脂飼料，后四周同時用吡格列酮灌胃，最后6天同時用氨苯砜腹腔注射。 1.2指標測定同第一部分。 結果： 1、食源性大鼠高脂血癥動物模型的建立給予高脂飼料前，大鼠的血脂水平無明顯差異(表1)。高脂飲食4周后，

14、大鼠血脂水平較四周前顯著提高，高脂飲食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平顯著高于同期普通飲食大鼠血脂水平(表3)。用吡格列酮干預(灌胃4周)后，高脂血癥大鼠血脂水平明顯下降(表4、圖17、圖18)。 2、吡格列酮干預后，高脂血癥誘導的血管內(nèi)皮功能障礙減輕與高脂血癥組相比，用吡格列酮干預后，ACh誘導logEC50明顯降低(P<0.05，圖19a)；同時，血管最大舒張程度顯著增加(P<0.01，圖19b、圖21a)。各組間S

15、NP誘導的血管舒張無明顯差異(圖20、圖21b)。吡格列酮干預后高脂血癥大鼠ACh誘導的血管舒張與用MPO抑制劑氨苯砜干預后ACh誘導的血管舒張無明顯差異，高脂血癥大鼠用吡格列酮和氨苯砜同時干預后，其ACh誘導的血管舒張與單純用吡格列酮干預后的血管舒張無明顯差異(圖19a、圖19b、圖21a)。 3、吡格列酮干預后，高脂血癥大鼠血管組織MPO活性降低吡格列酮干預后，高脂大鼠血管MPO活性顯著降低(P<0.01)，且與氨苯砜干預后

16、的大鼠血管MPO活性無明顯差異(圖22)。 4、吡格列酮干預后，高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能與MPO活性呈負相關為了進一步證實MPO在吡格列酮保護高脂血癥血管內(nèi)皮功能中的作用，對吡格列酮干預后各組血管內(nèi)皮功能與MPO的活性進行相關性分析。結果顯示，ACh誘導血管舒張的logEC50值與MPO活性呈正相關(P<0.01，圖23)，即ACh誘導血管舒張的EC50值與MPO活性呈負相關；同時，ACh誘導的血管最大舒張程度與MPO活性呈負相

17、關(P<0.01，圖24)。 5、吡格列酮干預后，改善高脂血癥誘導的血管NO/cGMP/cGK信號轉導通路損傷。 6、吡格列酮干預后，高脂血癥大鼠血管組織Nox和cGMP含量均與MPO活性呈負相關為了進一步證實MPO與吡格列酮逆轉高脂血癥誘導的血管NO/cGMP/cGK信號轉導途徑受損的直接相關性，對吡格列酮干預后各組血管組織NOx和cGMP含量與MPO的活性進行相關性分析。 以上結果提示，吡格列酮可能通過抑制M