ABCC2、ABCC3及ABCC5基因表達(dá)與肝癌細(xì)胞多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，化療在預(yù)防術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可替代的作用，但肝癌的化療效果不佳，原因是多方面的，其中一個(gè)主要原因與多藥耐藥現(xiàn)象有關(guān)。多藥耐藥現(xiàn)象一直是限制腫瘤化療成功的主要原因，引起腫瘤多藥耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為可能存在的耐藥機(jī)制有藥理學(xué)機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥備受關(guān)注。 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全稱為ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPBindingCassetteTrans

2、porters)，它們能夠介導(dǎo)多種底物分子在細(xì)胞內(nèi)外的運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的泵功能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物聚集的降低有關(guān)，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance,MDR)的主要原因。成為腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的重要防御機(jī)制。根據(jù)序列同源性及跨膜域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為七個(gè)亞家族(ABCA-G)，目前為止，在人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ABC家族有48個(gè)成員，與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白主要集中于ABCA、ABCB、AB

3、CC和ABCG這幾個(gè)亞家族中。 腫瘤多藥耐藥是腫瘤化療失敗的最常見(jiàn)原因，是人類治療腫瘤的一大障礙。腫瘤細(xì)胞或者在治療的初始階段就對(duì)多種抗腫瘤藥物無(wú)明顯反應(yīng)(內(nèi)在性耐藥)；或者是在經(jīng)過(guò)幾個(gè)療程后，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生了耐藥性(獲得性耐藥)。當(dāng)前，在肝癌的治療中，腫瘤耐藥的現(xiàn)象被認(rèn)為是肝癌化療效果無(wú)法進(jìn)一步提高的主要原因之一，研究表明與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于肝癌耐藥基因的檢測(cè)幾乎都是檢測(cè)病理標(biāo)本中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而且

4、文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)多是有關(guān)ABCB1、ABCC1和ABCG2基因編碼的多藥耐藥蛋白MDR1(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1、乳腺癌耐藥蛋白BCRP的文章。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ABCC亞家族至少包含有九個(gè)成員(MRP1-9)，其中ABCC2、ABCC3、ABCC5可能也參與了腫瘤的耐藥，但它們?cè)诟伟┲械谋磉_(dá)是否與肝癌的耐藥有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)還鮮見(jiàn)有相關(guān)的報(bào)道。 由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的耐受性是與細(xì)胞內(nèi)耐藥基因的表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)的，因此檢測(cè)耐藥基因

5、在藥物誘導(dǎo)前后表達(dá)強(qiáng)度的變化就可以發(fā)現(xiàn)可能參與耐藥的有關(guān)基因。腫瘤耐藥的產(chǎn)生往往涉及多個(gè)耐藥基因的表達(dá)，是多個(gè)基因參與的結(jié)果，自從MDR1基因發(fā)現(xiàn)以來(lái)，新的耐藥相關(guān)基因不斷被發(fā)現(xiàn)，顯然檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)能更好的判斷預(yù)后，比僅僅檢測(cè)單個(gè)基因的更有意義。為了解多藥耐藥相關(guān)蛋白成員與肝癌耐藥的相關(guān)性，進(jìn)一步探討肝癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制，我們檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中編碼多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)的ABCC亞家族中ABCC2mRNA、ABCC3mRNA、ABC

6、C5mRNA的表達(dá)，研究其表達(dá)是否與肝癌的耐藥有關(guān)，并進(jìn)一步為肝癌化療的藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。 目前常用的幾種檢測(cè)目的基因表達(dá)的方法有：形態(tài)學(xué)方法，熒光原位雜交(FISH)，流式細(xì)胞儀等，均存在著檢出率較低的弊端，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可以從105-106正常細(xì)胞中檢測(cè)出一個(gè)目的細(xì)胞，是公認(rèn)的比較敏感的檢測(cè)方法，但傳統(tǒng)PCR技術(shù)只能做到定性或半定量檢查，不能精確定量。一種理想的檢測(cè)方法應(yīng)具備如下條件：特異性強(qiáng)，敏感度高，重復(fù)

7、性好，快速簡(jiǎn)便，定量分析。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Real-timefluorescentquantitativePCR.)的出現(xiàn)為解決這一難題提供了新的思路。 采用SYBRGreenIQRT-PCR(quantitatierealtimePCR)技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。SYBRGreenI是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。因此，它的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信

8、號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量，從而對(duì)靶基因進(jìn)行定量分析，其準(zhǔn)確性和靈敏性都比普通RT-PCR高。 本課題采用SYBRGreenIQRT-PCR方法檢測(cè)ABCC亞家族中ABCC2mRNA、ABCC3mRNA、ABCC5mRNA的表達(dá)，探討ABCC2、ABCC3、ABCC5基因的表達(dá)與肝癌耐藥的關(guān)系。 目的: 1.建立熒光定量RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)水平的方法； 2.利用SYBRGreen

9、熒光定量PCR方法，在mRNA水平上檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)蛋白ABCC2、ABCC3、ABCC5在肝臟正常細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肝癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)，并比較他們?cè)谌N細(xì)胞中表達(dá)的差異性，以期進(jìn)一步闡明肝癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制是否與ABCC2、ABCC3、ABCC5的表達(dá)有關(guān)。 材料和方法: 1.根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)合成引物，培養(yǎng)肝臟正常細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，肝癌耐藥細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 2.純化管家基因beta-act

10、in的PCR產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶連接入pGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌DH-5α中，克隆出陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板按10倍梯度稀釋，在PE7700型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立起熒光定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平的方法。取肝臟正常細(xì)胞，肝癌細(xì)胞，肝癌耐藥細(xì)胞的cDNA，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行目的基因ABCC2mRNA、ABCC3mRNA、ABCC5mRNA的檢測(cè)，由軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣品的準(zhǔn)確含量，最后

11、對(duì)該方法的靈敏度，特異性，重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果: 1、提取的細(xì)胞總RNA質(zhì)量完好，常規(guī)RT-PCR可擴(kuò)增出特異性目的條帶，將重組質(zhì)粒做為陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，建立了熒光定量RT-PCR檢測(cè)目的基因的方法，得到一組反應(yīng)核酸擴(kuò)增的S型動(dòng)力曲線和一條定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，起始模板的對(duì)數(shù)值與循環(huán)域值(CT)值之間有良好的相關(guān)關(guān)系(r=0.991，P<0.01)。 2、正常肝細(xì)胞組，肝癌細(xì)胞組，肝癌耐藥細(xì)胞組中ABCC2mR

12、NA、ABCC3mRNA、ABCC5mRNA檢測(cè)結(jié)果如下(單位copies/ulRNA)： (1)ABCC2mRNA在正常肝臟細(xì)胞組，肝癌細(xì)胞組，肝癌耐藥細(xì)胞組的平均表達(dá)水平分別為：7858±656、8908±681、43920±4630；其在正常肝細(xì)胞組與肝癌細(xì)胞組間的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異(P=0.397)，而他們與肝癌耐藥細(xì)胞組間的表達(dá)均有顯著性差異(P=0.000)。 (2)ABCC3mRNA在正常肝臟細(xì)胞組，肝癌細(xì)

13、胞組，肝癌耐藥細(xì)胞組的平均表達(dá)水平分別為：3767±320、6558±616、86110±4227；其在正常肝細(xì)胞組與肝癌細(xì)胞組間的表達(dá)具有顯著性差異(P=0.018)，而他們與肝癌耐藥細(xì)胞組間的表達(dá)亦均有顯著性差異(P=0.000)(3)ABCC5mRNA在正常肝臟細(xì)胞組，肝癌細(xì)胞組，肝癌耐藥細(xì)胞組的平均表達(dá)水平分別為：13810±896、35060±1959、66370±1496；其在正常肝細(xì)胞組，肝癌細(xì)胞組，肝癌耐藥細(xì)胞組三組間的

14、表達(dá)均有顯著性差異(P=0.000)。 結(jié)論: 1.ABCC2、ABCC3、ABCC5在三種細(xì)胞中均有表達(dá)，ABCC2基因在BEL/ADM細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于在L-02、BEL細(xì)胞中的表達(dá)，而其在L-02，BEL兩種細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，提示ABCC2可能參與了肝癌的內(nèi)在性耐藥；ABCC3、ABCC5基因表達(dá)量在L-02、BEL、BEL/ADM三種細(xì)胞中均有顯著性差異，提示ABCC3、ABCC5可能與肝癌的獲得性