miR-125b通過調控Bcl-2和ABCC4的表達影響A549-DDP細胞系耐藥性的研究.pdf

1、目的:
　　肺癌是當前發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤。而肺癌細胞發(fā)生多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是導致肺癌化療失敗、預后不佳的最主要原因。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2和ABCC4蛋白在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達,并可能介導了腫瘤MDR的發(fā)生。本課題旨在觀察miR-125b在A549及其耐藥細胞株A549/DDP中的表達差異,探討miR-125b對Bcl-2和ABCC4的mRNA及蛋白表達的調控及其意義。

2、　　方法:
　　1.通過miRNA芯片檢測肺腺癌細胞株A549及其多藥耐藥細胞株A549/DDP的miRNA表達譜,找出差異表達的miRNA。
　　2.通過qRT-PCR對芯片結果進行驗證。
　　3.通過生物信息學軟件對miR-125b的靶基因進行預測。
　　4.通過熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因。
　　5.將miR-125b的模擬物轉染至A549/DDP細胞株中,檢測其靶基因蛋白的表達。
　　6.通

3、過MTT實驗檢測miR-125b對肺癌耐藥細胞株A549/DDP藥物敏感性的影響。
　　7.通過流式細胞術分析miR-125b對肺癌多藥耐藥細胞細胞株A549/DDP的凋亡敏感性的影響。
　　結果:
　　1.通過對A549和A549/DDP中miRNAs表達譜數(shù)據(jù)進行分析,以A549細胞株為對照組,差異值≥1.19(P<0.05)為篩選標準,得22條有差異表達的miRNA,其中耐藥株A549/DDP中上調的miRNA有

4、14條,下調的miRNA有8條。
　　2.將表達差異顯著的兩種miRNA進行實時定量PCR檢測,結果顯示:miR-125b的表達在A549/DDP細胞中較A549細胞中顯著降低,而mir-24的表達顯著升高,這一結果與miRNA芯片結果一致,提示miRNA芯片結果能正確反映A549和A549/DDP細胞株中miRNA的表達差異。
　　3.通過查閱相關文獻并利用生物信息學軟件,發(fā)現(xiàn)在miR-125b預測的靶基因中包括Bcl-2

5、及ABCC4,且兩種基因已被證實在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。
　　4.miR-125b通過結合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的Bcl-23’UTR及ABCC4-23’UTR的靶位點,抑制熒光素酶表達,破壞該靶位點可以解除 miR-125b對熒光素酶表達的抑制效應。
　　5.與對照細胞相比,轉染miR-125b模擬物的A549/DDP細胞的Bcl-2和ABCC4蛋白水平明顯降低。
　　6.體外藥物敏感性實驗表明,相對于對照組

6、,轉染miR-125b模擬物的A549/DDP細胞對不同化療藥物的敏感性顯著增加。
　　7.流式細胞術分析結果表明,與對照細胞相比,轉染miR-125b模擬物的A549/DDP細胞對化療藥物誘導的凋亡的敏感性顯著增加。
　　結論:
　　1.miRNA在肺腺癌細胞株A549和多藥耐藥細胞株A549/DDP中的表達存在差異,這些差異表達的miRNA可能參與肺癌多藥耐藥的產(chǎn)生。
　　2.miR-125b可能是通過抑制其