人肝癌多藥耐藥細(xì)胞MAPK激酶表達(dá)與活性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)細(xì)胞的存在是肝癌化療失敗的根本原因。研究顯示，抗腫瘤藥物能夠引起絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的激活及MDR的產(chǎn)生，而通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞MAPK激酶系統(tǒng)的表達(dá)有可能逆轉(zhuǎn)MDR。本課題擬采用阿霉素和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)建立多株穩(wěn)定的MDR肝癌細(xì)胞模型，并對(duì)肝癌細(xì)胞(MDR+/

2、MDR-細(xì)胞)中MAPK表達(dá)譜進(jìn)行研究，旨在深入探討MAPK家族成員的表達(dá)與活性對(duì)肝癌細(xì)胞MDR的影響，期望能為MAPK作為逆轉(zhuǎn)治療肝癌細(xì)胞MDR的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法誘導(dǎo)親本細(xì)胞建立人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU，MTT法測(cè)定其多藥耐藥性。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期并檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp(P-glycop

3、rotein)和MRP1(multidrug resistant protein1)表達(dá)。熒光定量PCR檢測(cè)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中MAPK關(guān)鍵激酶的mRNA表達(dá)，western-blot檢測(cè)MAPK關(guān)鍵激酶蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。采用MAPK通路磷酸化抗體芯片篩選人肝癌多藥耐藥細(xì)胞HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU與親本細(xì)胞間差異表達(dá)的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘

4、導(dǎo)建立的HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU細(xì)胞不僅對(duì)各自的誘導(dǎo)藥物ADM及5-FU存在耐藥性，而且對(duì)其它多種化療藥物均存在耐藥性。與親本細(xì)胞相比較，人肝癌多藥耐藥細(xì)胞P-gp表達(dá)量顯著增高，而MRP1的表達(dá)并無(wú)顯著變化。細(xì)胞周期分析顯示，HepG2/ADM細(xì)胞G2/M期細(xì)胞分布比率明顯增高，SMMC7721/ADM細(xì)胞S期比率明顯增高，而B(niǎo)EL7402/5-FU細(xì)胞G0/G1期比率明顯增高伴隨有S期

5、比率明顯降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中均可檢測(cè)到ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、P38α、P38β、P38γ、P38δ及ERK5 mRNA表達(dá)，它們?cè)贐EL-7402/5-FU和SMMC7721/ADM中的表達(dá)水平全部是顯著降低的，但在HepG2/ADM中，除P388 mRNA表達(dá)無(wú)差異外，其余9種MAPK關(guān)鍵激酶的mRNA表達(dá)都是增高的。Western-blot檢測(cè)顯示，MAPK關(guān)鍵激

6、酶的蛋白表達(dá)水平變化多樣，其蛋白磷酸化水平相對(duì)一致；p-ERK1及p-ERK2蛋白在HepG2/ADM和SMMC7721/ADM中的表達(dá)水平明顯降低，但在BEL-7402/5-FU中的表達(dá)水平增高；p-JNK1和p-JNK2/3蛋白表達(dá)水平在SMMC7721/ADM中明顯降低，但在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU中沒(méi)有明顯變化；p-ERK5蛋白表達(dá)在HepG2/ADM中無(wú)明顯變化，但在SMMC7721/ADM和BEL-74

7、02/5-FU中明顯降低。MAPK通路磷酸化抗體芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，p-P38蛋白表達(dá)在HepG2/ADM明顯增高(約11.8倍)，而在BEL-7402/5-FU則降低；在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU細(xì)胞中均出現(xiàn)同樣改變的蛋白被認(rèn)為是恒定的差異表達(dá)蛋白，共有12個(gè)蛋白，占MAPK通路磷酸化抗體芯片總蛋白數(shù)的6.49％，可能為人肝癌多藥耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞間的差異表達(dá)蛋白。其中表達(dá)升高的蛋白有1個(gè)，表達(dá)降低的蛋白有11個(gè)，涉

8、及MAPK通路上游激活物、MAPK上游激酶以及下游底物等多個(gè)水平。
　　 結(jié)論：
　　 (1)采用藥物濃度梯度遞增誘導(dǎo)法成功建立人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU；與親本細(xì)胞相比較，人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，這種改變不僅與耐藥腫瘤細(xì)胞的增殖能力降低有關(guān)，而且可能是多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制之一；P-gp參與了人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，而

9、MRP1與之無(wú)關(guān)。
　　 (2)MAPK關(guān)鍵激酶在人肝癌多藥耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞中均普遍表達(dá)；對(duì)于P-gp介導(dǎo)MDR的人肝癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞，MAPK關(guān)鍵激酶在基因水平、蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的表達(dá)變化趨勢(shì)并不一致；多數(shù)情況下，ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3和ERK5的活性與MDR間呈負(fù)相關(guān)，但P38活性表達(dá)與MDR是正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，尚需深入研究加以明確。
　　 (3)蛋白芯片能夠成功篩選出人肝癌多藥