人肝癌多藥耐藥細胞MAPK激酶表達與活性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)細胞的存在是肝癌化療失敗的根本原因。研究顯示，抗腫瘤藥物能夠引起絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)信號傳導系統(tǒng)的激活及MDR的產(chǎn)生，而通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞MAPK激酶系統(tǒng)的表達有可能逆轉MDR。本課題擬采用阿霉素和5-氟尿嘧啶誘導建立多株穩(wěn)定的MDR肝癌細胞模型，并對肝癌細胞(MDR+/

2、MDR-細胞)中MAPK表達譜進行研究，旨在深入探討MAPK家族成員的表達與活性對肝癌細胞MDR的影響，期望能為MAPK作為逆轉治療肝癌細胞MDR的分子靶點提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用藥物濃度梯度遞增誘導法誘導親本細胞建立人肝癌多藥耐藥細胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU，MTT法測定其多藥耐藥性。流式細胞儀分析細胞周期并檢測多藥耐藥相關蛋白P-gp(P-glycop

3、rotein)和MRP1(multidrug resistant protein1)表達。熒光定量PCR檢測人肝癌多藥耐藥細胞和親本細胞中MAPK關鍵激酶的mRNA表達，western-blot檢測MAPK關鍵激酶蛋白表達及其磷酸化水平。采用MAPK通路磷酸化抗體芯片篩選人肝癌多藥耐藥細胞HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU與親本細胞間差異表達的MAPK信號轉導通路蛋白。
　　 結果：
　　 MTT檢測發(fā)現(xiàn)，誘

4、導建立的HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU細胞不僅對各自的誘導藥物ADM及5-FU存在耐藥性，而且對其它多種化療藥物均存在耐藥性。與親本細胞相比較，人肝癌多藥耐藥細胞P-gp表達量顯著增高，而MRP1的表達并無顯著變化。細胞周期分析顯示，HepG2/ADM細胞G2/M期細胞分布比率明顯增高，SMMC7721/ADM細胞S期比率明顯增高，而BEL7402/5-FU細胞G0/G1期比率明顯增高伴隨有S期

5、比率明顯降低。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)人肝癌多藥耐藥細胞和親本細胞中均可檢測到ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、P38α、P38β、P38γ、P38δ及ERK5 mRNA表達，它們在BEL-7402/5-FU和SMMC7721/ADM中的表達水平全部是顯著降低的，但在HepG2/ADM中，除P388 mRNA表達無差異外，其余9種MAPK關鍵激酶的mRNA表達都是增高的。Western-blot檢測顯示，MAPK關鍵激

6、酶的蛋白表達水平變化多樣，其蛋白磷酸化水平相對一致；p-ERK1及p-ERK2蛋白在HepG2/ADM和SMMC7721/ADM中的表達水平明顯降低，但在BEL-7402/5-FU中的表達水平增高；p-JNK1和p-JNK2/3蛋白表達水平在SMMC7721/ADM中明顯降低，但在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU中沒有明顯變化；p-ERK5蛋白表達在HepG2/ADM中無明顯變化，但在SMMC7721/ADM和BEL-74

7、02/5-FU中明顯降低。MAPK通路磷酸化抗體芯片檢測結果顯示，p-P38蛋白表達在HepG2/ADM明顯增高(約11.8倍)，而在BEL-7402/5-FU則降低；在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU細胞中均出現(xiàn)同樣改變的蛋白被認為是恒定的差異表達蛋白，共有12個蛋白，占MAPK通路磷酸化抗體芯片總蛋白數(shù)的6.49％，可能為人肝癌多藥耐藥細胞與親本細胞間的差異表達蛋白。其中表達升高的蛋白有1個，表達降低的蛋白有11個，涉

8、及MAPK通路上游激活物、MAPK上游激酶以及下游底物等多個水平。
　　 結論：
　　 (1)采用藥物濃度梯度遞增誘導法成功建立人肝癌多藥耐藥細胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU；與親本細胞相比較，人肝癌多藥耐藥細胞系細胞周期分布發(fā)生改變，這種改變不僅與耐藥腫瘤細胞的增殖能力降低有關，而且可能是多藥耐藥產(chǎn)生的機制之一；P-gp參與了人肝癌多藥耐藥細胞系藥物轉運泵介導的耐藥機制，而

9、MRP1與之無關。
　　 (2)MAPK關鍵激酶在人肝癌多藥耐藥細胞和親本細胞中均普遍表達；對于P-gp介導MDR的人肝癌細胞多藥耐藥細胞，MAPK關鍵激酶在基因水平、蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的表達變化趨勢并不一致；多數(shù)情況下，ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3和ERK5的活性與MDR間呈負相關，但P38活性表達與MDR是正相關或負相關，尚需深入研究加以明確。
　　 (3)蛋白芯片能夠成功篩選出人肝癌多藥