基底節(jié)環(huán)路活動(dòng)變化在異動(dòng)癥發(fā)生機(jī)制中作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥大鼠基底節(jié)區(qū)傳出通路功能變化的研究
　　目的:檢測(cè)左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥(LID)大鼠模型基底節(jié)區(qū)直接通路和間接通路上PPE mRNA、PDyn mRNA和NGFI-B mRNA基因的表達(dá)。結(jié)合大鼠行為學(xué)的變化,初步探討基底節(jié)區(qū)環(huán)路功能變化與LID形成間的關(guān)系。
　　方法:6-羥多巴胺(6-OHDA)腦立體定位注射制備偏側(cè)帕金森病大鼠模型,然后每天一次給予復(fù)

2、方左旋多巴(10mg/kg/d)腹腔注射治療28天,誘發(fā)異常不自主運(yùn)動(dòng)(AIM)建立LID大鼠模型,觀察其行為學(xué)特點(diǎn)。隨機(jī)選出復(fù)方左旋多巴治療8天后出現(xiàn)AIM的PD大鼠,于第9天開始在L-dopa治療前15min分別加用SCH23390(1mg/kg/d)和氟哌啶醇(1mg/kg/d)腹腔注射治療直至第28天。觀察各組大鼠行為學(xué)變化,并用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠損傷側(cè)紋狀體區(qū)PPE mRNA、PDyn mRNA和N

3、GFI-B mRNA基因表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:經(jīng)慢性間斷性復(fù)方左旋多巴治療后,80％的PD大鼠出現(xiàn)與合并LID的PD病人臨床表現(xiàn)相似的異常運(yùn)動(dòng),主要表現(xiàn)為損毀對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙,軸性肌張力障礙和口面部運(yùn)動(dòng)障礙和對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。經(jīng)SCH23390治療后的大鼠,其AIM評(píng)分顯著下降,而氟哌啶醇治療后,AIM評(píng)分無顯著改變。
　　大鼠損毀側(cè)紋狀體區(qū)PPE mRNA的表達(dá)量:PD組(1.52±0.24)顯著高于正常對(duì)照組(0.97±0

4、.28)、LID組(1.65±0.23)、SCH23390組(1.62±0.69)和氟哌啶醇組(1.58±0.73),其差異均具有顯著性意義(分別為P<0.05);PDyn mRNA相對(duì)表達(dá)量:LID組(1.80±0.28)顯著高于PD組(0.95±0.31)和正常對(duì)照組(1.26±0.36)(均為P<0.05),氟哌啶醇組(1.69±0.92)顯著高于SCH23390組(0.98±0.39)(P<0.05),SCH23390組明顯低于

5、LID組(P<0.05);NGFI-B mRNA的相對(duì)表達(dá)量:LID組(14.98±0.43)高于PD組(11.38±1.02)和正常對(duì)照組(8.3±0.67)(P<0.05),SCH23390組(14.26±0.69)與LID組相比差異無顯著性意義(P>0.05),氟哌啶醇組(18.01±0.73)分別顯著高于LID組和SCH23390組(P<0.05)。
　　結(jié)論:LID的形成與長(zhǎng)期左旋多巴治療后紋狀體區(qū)傳出通路上的長(zhǎng)期適應(yīng)性

6、改變及兩傳出通路間功能的失衡有關(guān),其中直接通路上NGFI-B和PDyn基因表達(dá)的上調(diào)和該通路活性的增高起重要作用。
　　第二部分 NMDAR表達(dá)變化與左旋多巴誘發(fā)異動(dòng)癥間關(guān)系的研究
　　目的:研究LID形成過程中的作用,紋狀體谷氨酸NMDA受體NR1、NR2A和NR2B亞單位在突觸部位的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和磷酸化修飾變化。
　　方法:成年雌性SD大鼠6-羥多巴胺腦立體定位注射制備偏側(cè)帕金森病大鼠模型,然后每天一次給予復(fù)方左旋多

7、巴腹腔注射治療28天(10mg/kg/d),誘發(fā)異動(dòng)癥建立LID大鼠模型。隨機(jī)選出復(fù)方左旋多巴治療8天后出現(xiàn)AIM的PD大鼠,于第9天開始在L-dopa治療前15min加用SCH23390(1mg/kg/d)和等量生理鹽水腹腔注射治療至第28天,觀察各組大鼠的行為學(xué)變化。以蔗糖密度梯度離心方法分別分離出大鼠損傷側(cè)紋狀體的組織勻漿和突觸小體,用免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)兩者中NR1、NR2A和NR2B亞單位蛋白表達(dá)的變化,同時(shí)檢測(cè)各組大鼠組織勻

8、漿中p-NR1(Ser896/897)和p-NR2B(Tyr1472)的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:NMDA受體的NR1、NR2A和NR2B亞單位在各組大鼠損傷側(cè)紋狀體組織勻漿中蛋白表達(dá)量均無顯著改變(P>0.05)。在突觸小體中的蛋白表達(dá)量:NR1亞單位在各組間相比差異均無顯著性意義(P>0.05);NR2A亞單位在PD組顯著高于其他四組(均為P<0.05);NR2B亞單位在PD組顯著低于正常對(duì)照組,而在LID組則顯著高于PD組和

9、SCH23390組(均為P<0.05),但LID對(duì)照組與LID組相比差異無顯著性意義(P>0.05)。大鼠損傷側(cè)紋狀體組織勻漿中p-NR1(Ser896/897)和p-NR2B(Tyr1472)的蛋白表達(dá)量:在LID組均分別顯著高于正常對(duì)照組、PD組和SCH23390組(均為P<0.05),但與LID對(duì)照組相比差異無顯著性意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:長(zhǎng)期間斷性左旋多巴治療過度活化多巴胺D1受體介導(dǎo)的直接通路,誘發(fā)NR2B亞單

10、位向紋狀體突觸部位的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位增多和NR1(Ser896/897)絲氨酸磷酸化修飾與NR2B(Tyr1472)亞單位酪氨酸磷酸化修飾的異常增強(qiáng),導(dǎo)致NMDA受體功能改變,皮質(zhì)紋狀體谷氨酸突觸可塑性發(fā)生變化,從而誘發(fā)了LID的形成。
　　第三部分 CDK5在左旋多巴治療誘發(fā)的異動(dòng)癥形成中作用的研究
　　目的:研究左旋多巴誘發(fā)的異動(dòng)癥大鼠紋狀體區(qū)CDK5的蛋白表達(dá)變化及DARPP-32不同位點(diǎn)(Thr75和Thr34)的磷酸化修

11、飾變化情況,探討CDK5在直接通路過度活化和LID形成過程中的作用。
　　方法:成年雌性SD大鼠6-羥多巴胺腦立體定位注射制備偏側(cè)帕金森病大鼠模型,然后以復(fù)方左旋多巴(10mg/kg/d)腹腔注射治療28天誘發(fā)異動(dòng)癥建立LID大鼠模型。復(fù)方左旋多巴治療第28天的LID大鼠,以選擇性CDK5拮抗劑Roscovitine(50nmol/1μl)紋狀體內(nèi)注射治療一次,12小時(shí)后繼續(xù)左旋多巴治療。觀察各組大鼠的行為學(xué)變化。采用免疫印跡技術(shù)

12、檢測(cè)損傷側(cè)紋狀體區(qū)總DARPP-32和CDK5的蛋白水平及DARPP-32的phospho-Thr75位點(diǎn)和phospho-Thr34位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)的變化。
　　結(jié)果:左旋多巴治療第28天成功的LID大鼠模型平均AIM評(píng)分為24.8。Roscovitine治療組大鼠的AIM明顯減輕,其第28天AIM評(píng)分顯著低于LID組(P<0.05)。而LID對(duì)照組大鼠AIM評(píng)分與LID組大鼠相比差異無顯著性意義(P>0.05)。大鼠損毀側(cè)紋狀體

13、區(qū)CDK5的蛋白表達(dá)量PD組高于正常對(duì)照組(P<0.05),LID組顯著高于PD組、非LID組和正常對(duì)照組(均為P<0.05),經(jīng)Roscovitine治療后CDK5表達(dá)量顯著下降,低于LID組(P<0.05),而Roscovitine對(duì)照組與LID組相比差異無顯著性意義(P>0.05)。大鼠損毀側(cè)紋狀體內(nèi)總DARPP-32蛋白表達(dá)在各組間比較差異均無顯著性意義。損毀側(cè)紋狀體區(qū)Thr34位點(diǎn)磷酸化的DARPP-32的蛋白表達(dá)量,LID組

14、分別顯著高于正常對(duì)照組、PD組、非LID組,Roscovitine治療組(均為P<0.05),而后四組間相互比較差異無顯著性意義(P>0.05)。Thr75位點(diǎn)磷酸化的DARPP-32的蛋白表達(dá)量:在正常對(duì)照組、PD組、非LID組與LID組間比較,差異均無顯著性意義(P>0.05),而在Roscovitine治療組,其表達(dá)顯著高于LID組(P<0.05),但LID組與Roscovitine對(duì)照組相比差異無顯著性意義(P>0.05)。